第十五章分子杂交技术讲稿

第十五章 分子杂交技术

第一节 核酸杂交的基本原理

1、核酸分子杂交定义：

在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把 DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链（heteroduplex）（参照图讲解）。

2、探针技术

2.1 探针 (probe) 定义：

一段常用同位素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，与

固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在（参照图讲解）。

2.2 探针形式（举例说明）

3、核酸的变性

 在物理或化学因素的影响下，维系核酸二级结构的氢键和碱基堆积力受到破坏，DNA双螺旋解旋成为单链的过程称为核酸的变性（denaturation）。

 变性的DNA粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加。

加热变性是实验室最常用的方法

 一般当温度在70℃以内时，DNA几乎不变性；

 温度在70～90℃之间时，DNA部分变性；

 温度大于90 ℃时，DNA变性使双链打开，温度大于100℃时，DNA双链分离。 增色效应：DNA变性时其溶液OD260增高的现象。

 在热变性过程中，通常将增色效应达一半时即双螺旋被解开一半时的温度称为变性温度或融解温度（melting temperature），用Tm表示。

 影响 Tm值的因素 ：

（1）碱基的组成：

GC含量愈高的DNA不易变化，其Tm值愈高。

在标准条件下即0.15mol/L Nacl 0.15mol/L柠檬酸钠溶液中（1×ssc）， Tm值与碱基对组成之间的经验公式是：Tm =69.3+0.14（G+C）%

Tm值还与DNA分子的长度有关，DNA分子越长，Tm值越大。

（2）溶液的离子强度：

在高离子强度溶液中，Tm值较高，解链温度范围较窄。

同一种DNA分子在不同离子强度溶液中其Tm值不同。

在高离子强度溶液中，Tm值较高，解链温度范围较窄。

（3）pH值：

核酸溶液的pH值在5～9范围内，Tm值变化不明显。当核酸溶液的pH低于3或高于10时，核酸的双链可以完全打开成为单链核酸分子。

（4）变性剂：

当核酸溶液中含有一定浓度的化学试剂如尿素、甲酰胺、二甲基亚砜等，可降低Tm值。

（5）其它：

RNA变性转变不如DNA明显.

二、核酸的复性

变性DNA只要消除变性条件，二条互补链还可以重新结合，恢复原来的双螺旋结构，这一过程称为复性（renaturation）。

影响DNA复性速度的因素：

主要为DNA样品的性质，如简单序列的DNA要比顺序复杂的DNA复性快；DNA浓度高，使分子之间碰撞机会增加，复性快；长的DNA分子运动慢，复性速度低，复性最快的DNA片段为基因组中的高度重复序列。

复性可分为两个阶段：首先是成核，其次是拉链式。

 复性反应速度

1. 用Cot值来衡量，它是DNA分子的起始浓度Co (以 mol/L 表示) 与复性时间（t）的乘积，单位是mol . Sec . L-1。

2. 任何DNA的复性都可用Cot 1/2表示，Cot 1/2越大，复性反应越慢。

3．核酸的杂交及影响杂交的因素

3.1 温度与时间

 杂交反应温度一般低于Tm 10～15℃。

 核苷酸杂交的有效反应时间从理论上讲，在3h左右。 但为稳妥起见，一般将杂交反应时间定为16～20h，或为简便起见杂交孵育过夜。（具体实验具体对待）。

3.2 离子强度

在低离子强度下，核酸杂交非常缓慢，随着离子强度的增加，杂交反应率增加。在进行序列不完全同源的核酸分子杂交时，必须维持杂交反应液中较高的盐酸浓度和洗膜溶液的盐浓度。

3.3 探针的浓度和长度：

 探针长度控制在50～300bp为好。

 双链探针的浓度一般为0.1-0.5 μg/ml。

 杂交时如果使用单链核酸探针，随着溶液中探针浓度的增加，杂交效率也增加。

3.4 非特异性杂交反应

 为减少非特异性杂交反应，在杂交前将非特异性杂交位点进行封闭，以减少其对探针的非特异性吸附作用。常用的封闭物：鲑鱼精子DNA（salmon sperm DNA）或小牛胸腺（calf thymus DNA)、Denhardt溶液，也可用脱脂奶粉。

第二节 核酸分子杂交技术

1、固相分子杂交定义：

固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固体支持物上，一条反应核酸链游离在溶液中，固体支持物有硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠和微孔板等。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。

滤膜杂交的基本过程：

该方法分为菌落印迹原位杂交、斑点印迹杂交、southern印迹杂交和Northern印迹杂交四类。

完成一个滤膜杂交实验一般包括的步骤（以Southern blotting 为例）：

⑴ 核酸的制备

⑵ 电泳

⑶ 印迹

⑷ 预杂交

⑸ 杂交

⑹ 洗膜

⑺ 检测

理想的滤膜应符合以下要求：

 具有较强的结合核酸分子的能力；

 与核酸分子结合后，应不影响其与探针分子的杂交反应；

 与核酸分子结合牢固，能经受杂交、洗膜等操作过程而不致于脱落或脱落极少；  非特异性吸附少，在漂洗过程中能将非特异性吸附在其表面的探针分子洗脱掉；  具有良好的机械性能，如柔软性好,韧性强等,以便于操作。

目前常用的滤膜有：

 硝酸纤维素膜（nitrocellulose filter membrane）

 尼龙膜（nylon membrane）

硝酸纤维素膜：

 用于放射性和非放射性标记探针都很方便，产生的本底浅，经80℃烤干2h和杂交处理后，核酸仍不会脱落。硝酸纤维素膜的另一特点是只与蛋白有微弱非特异结合，这在使用非同位素探针中尤为有用。硝酸纤维素膜的缺点是结合核酸能力的大小取决于转印条件和高浓度盐（＞10×SSC），与小片段核酸（＜200bp）结合不牢，质地脆，不易操作。

 尼龙膜：

强度大、耐用，可反复使用。比硝酸纤维素膜具有较强的结合核酸的能力。缺点是对蛋白有高亲合力，不宜使用非同位素探针。

以哺乳动物基因组DNA为例，介绍southern印迹杂交的几个基本步骤。

1.1.1 待测样品的制备

（1）制备待测DNA

 较理想的DNA样品应达到：

 ①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过度浓度的金属离子；

 ②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；

 ③排除RNA分子的污染与干扰。

（2）DNA的限制酶消化

 通常用限制酶消化DNA，一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶消化基因组DNA。

1.1.2 待测DNA样品的电泳分离

 采用琼脂糖凝胶电泳分离基因组DNA的酶切片段。凝胶浓度取决于欲鉴定DNA片段的长度，大片段的DNA采用低浓度胶，小片段DNA采用高浓度胶，浓度为0.8%的胶能有效分离1～20kb的片段。

 含DNA片段的琼脂糖凝胶进行碱变性及中和处理。将凝胶置于碱溶液中浸泡，使DNA变性断裂，形成较短的单链DNA片段，再用中性pH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。将凝胶中的DNA片段转移到膜上的过程中，最重要的是要保持各片段的相对位置不变。

1.1.3 将凝胶中的核酸片段印迹到滤膜上的方法有：毛细管虹吸印迹法、电转移法、真

空转移法。

（1）毛细管虹吸印迹法

这是一传统方法，本法不需特殊装置，器具简单，缺点是转移时间较长，转移后杂

交信号较弱。

（2）电转印法

利用电场的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上，可达到简单、迅速、高效的目的。一般2-3小时内可转移完毕。电转法不宜采用NC膜，一般使用尼龙膜。此外，电转过程中转移体系的温度升高，必须使用循环冷却水。转移大片段DNA效果明显。

（3）真空转移

这一方法的最大优点是快速高效，可在转膜的同时进行DNA的变性与中和，30分钟至1小时可完成，缺点是如不小心，会使凝胶碎裂, 并且在洗膜不严格时，其背景比毛细转移要高。

1.1.4 探针的制备

可以是纯化的DNA片段或寡核苷酸片段，大多数通过克隆或PCR获得的DNA都用缺口平移或随机引物标记的方法制备探针，探针可用核素标记，也可用非核素标记。

1.1.5 杂交

 基本过程相同，即预杂交、杂交、洗膜。

 杂交时间、杂交液体系、杂交温度等需根据情况调整。

1.1.6 杂交结果的检测

 采用核素标记的探针或发光剂标记的探针;

 采用非核素标记的探针进行杂交时，可直接在膜上显色，显出杂交条带。

1.1.7 Southern杂交的应用范围

主要用于基因组中特定基因的定性和定量，基因突变分析等。

1.2 Northern印迹杂交

Northern印迹杂交是指细胞总RNA或mRNA经变性、电泳分离，再转移到固相支持物上与探针杂交的实验技术。

1.3 Northern印迹与Southern印迹的区别：

不需酶切；变性方式不同； RNA远不如DNA稳定，很容易被RNA酶降解.

RNA变性电泳的原理，是用一定剂量的乙二醛-二甲基亚矾，或甲醛和甲基氢氧化汞等处理RNA样品和凝胶，使双链RNA在电泳过程中变性而完全解离形成单链。

1.4 斑点及狭缝印迹杂交

是指将DNA或RNA样品直接点在硝酸纤维素滤膜上，然后与核酸探针分子杂交，以显示样品中是否存在特异的DNA或RNA。

1.5 原位杂交

 原位杂交是在分子生物学领域应用极为广泛的实验技术之一，是在研究生物体发育过程中的一种极为重要的分子遗传学的研究方法。其英文名为in situ hybridization。

 同时由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，而是在组织和细胞内进行DNA或RNA精确定位和定量的特异方法之一，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

原位杂交步骤：

1.5.1 组织或细胞的固定

 原位杂交主要是在载玻片上进行，载玻片的处理至关重要。

 固定液的选择（应具备）：⑴能更好地保持组织细胞的形态；⑵对核酸无抽提修饰、降解作用；⑶不改变核酸在组织细胞内的位置；⑷不影响靶核酸与探针的结合；⑸对杂交信号无遮蔽作用。

 固定时间视材料不同而定，固定细胞时一般为室温30分钟，固定组织则为室温1小时，固定时间太短，会使组织细胞固定不良，影响形态结构及核酸的保存；时间过长，可能会减低靶核酸对探针的可及性，使杂交信号减弱。

1.5.2 组织和细胞杂交前的预处理

杂交前必须用去垢剂和/或蛋白酶对组织细胞进行部分消化，以去除核酸表面的蛋白质，使探针易与靶核酸杂交，Triton-X-100和SDS是常用的去垢剂，目的是增加组织

细胞通透性，利于探针进入组织细胞。

要特别注意掌握蛋白酶K消化的程度，过度消化同样会引起组织形态结构的破坏及靶核酸的减少，还会导致标本从载玻片上脱落。

1.5.3 探针的选择和标记

用于原位杂交的探针可以是单链或双链DNA ，也可以是RNA探针。探针的长度选择对结果有一定影响，通常探针的长度以50～300bp为宜，也可以是寡核苷酸探针，这样的探针，穿透能力强，杂交效率高。

1.5.4 杂交

原位杂交是在载玻片上进行，杂交液的体积应尽量少，一般每张切片用10～20μl杂交液为宜，杂交液内除含一定浓度的标记探针外，还含有较浓度的盐、甲酰胺、硫酸葡聚糖、牛血清白蛋白及非特异性DNA，各有其作用。

1.5.5 杂交结果的检测

若应用放射性核素（同位素）标记探针，杂交后须经放射自显影，以对被检测的核酸进行定位与定量；若所用的非放射性标记的探针，则根据标记体系对杂交结果进行检测。

2、液相杂交

 液相杂交是指待测的核酸分子和标记的探针都存在于杂交液中，碱基互补的单链核酸分子在液体中配对形成杂交分子。

 近年发展的核酸酶S1保护分析法等检测RNA的技术均是以液相杂交为基础的。

2.1 RNA酶保护分析法

 （RNase protection assary,RPA）其原理是体外转录合成一个高比放射活性的单链RNA探针，此探针与待测RNA互补，二者杂交后，用RNase A和RNase T1消化，未形成双链的RNA单链被水解成单核苷酸，杂交形成的双链RNA受到保护，不被核酸酶水解，通过电泳进行RNA：RNA杂交体的检测，此法可用于mRNA定量、mRNA未端定位及确定内含子相应基因中的位置等。

2.2 核酸酶S1保护分析法

是一种比Northern印迹杂交敏感性更高的检测RNA的方法，可用于基因转录起始位点分析及内含子剪切位点分析。其原理与RNase保护分析法类似。核酸酶S1能降解单链DNA和RNA.

2.3 引物延伸分析法

引物延伸分析法可用于RNA 5‟端的定位及mRNA的定量，还可检测mRNA的前体和中间加工体。

第三节 核酸探针

1、核酸探针的类型

大致可以分为三大类: 即寡核苷酸探针、双链DNA探针以及单链DNA或RNA探针。 探针选择的最基本的原则是：其是否具有高度的特异性、其次也需考虑到制备探针难易性和检测手段的灵敏等其他因素。

1.1 寡核苷酸探针

一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。在确切DNA序列未知时常用。 寡核苷酸探针是由实验者设计，经核苷酸合成仪人工合成的。

人工合成寡核苷酸探针的优点是：

① 探针制备方便

② 当寡核苷酸探针与靶序列间存在着错配碱基时，所形成的杂交体稳定性明显下降 ③ 用新的酶促方法标记寡核苷酸可以得到高比活度标记探针，适用于大多数杂交实验 筛选寡核苷酸针的一些原则：

① 长18～30bp,较长探针杂交时间较长，合成量低；较短探针特异性会差些。 ② 碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交。 ③ 探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。 ④ 避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。

⑤ 一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。

在进行点突变检测杂交的反应时，洗膜条件和温度选择往往更为重要。所选漂洗条件必需使野生型靶DNA与探针产生强的杂交信号而突变型靶DNA则不产生杂交信号，这可以通过逐渐提高洗膜温度来完成。

1.2 双链探针

包括基因组DNA探针和cDNA探针。

基因组DNA探针

是利用机械剪切或限制性内切酶消化将基因组DNA制备成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当载体中，转化缩主细胞，构建成基因组DNA文库，进而从文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增，提取DNA，酶切及电泳分离，即可得到足够的基因片段，经适当标记后即可作为探针使用。

DNA探针（包括cDNA探针）的主要优点有下面三点：

① 这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。② DNA探针不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。③ DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法，PCR标记法等，能用于同位素和非同位素标记。

cDNA探针

① 构建成cDNA文库，进而从文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增，酶切及电泳分离，即可得到足够的cDNA片段，经适当标记后即可作为探针使用。 ② 利用PCR技术进行扩增：

先进行逆转录，合成一条cDNA，再进行PCR，扩增特异的cDNA片段，电泳分离、 纯化。

1.3 单链探针 ：

包括单链DNA探针和RNA探针；

单链探针仅由特定核酸序列的互补双链之一组成，避免了探针发生自我复性。

1.3.1 单链DNA、RNA探针的制备

单链DNA探针是利用M13噬菌体载体合成的，以M13载体衍生序列为模板,用Klenow片段合成单链探针；

单链RNA探针是以双链DNA为模板，利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶于体外转录合成的。

2、标记物

常用的探针标记物有二类：放射性同位素和非放射性同位素标记物。

2.1 放射性同位素

放射性同位素是目前最常用的探针标记物，它不影响探针与靶分子的特异结合，而且检测灵敏度高，可以检测到10-14～10-18g的物质。

放射性同位素标记核酸有以下优点：

（1）敏感度高

（2）特异性高

（3）方法简便

放射性同位素标记技术缺点：

① 半衰期短，必须经常标记探针

② 费用高

③ 检测时间长

④ 放射性同位素对人体有害

2.2 非放射性标记物

非放射性标记物具有安全可靠的优点，主要有以下几类。

2.2.1 半抗原：生物素（biotin）、地高辛（digoxigerin，DIG）都是半抗原，可以利用这些半抗原的抗体进行免疫学检测，根据显色反应检测杂交信号。

2.2.2 配体：生物素是抗生物素蛋白卵白素和链霉菌类抗生素蛋白的配体，可用亲和法检测。

2.2.3 荧光素：如罗丹明等可被紫外线激发出荧光而被检测到。

2.2.4 化学发光探针

有些标记物与另一类物质反应而产生化学发光现象，能直接对X-光胶片曝光。

3、标记方法

核酸的标记可以在体外进行，也可在体内进行；

无特殊目的和需要，核酸分子杂交所用探针几乎均采用体外（in vitron）标记法进行标记。体外标记分为化学法和酶法。

化学标记法是利用标记物上的基团与探针分子上的基团 发生化学反应。

化学标记法的特点是：简单、快速、均匀；

酶法：将标记物预先标记在核苷酸（NTP或dNTP）分子上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺入到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基团交换到探针分子上。

3.1 缺口平移法 （nick translation）

该技术由Kelly等于1970年创立。其原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些缺口（nick ）,缺口处会形成3‟-羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3‟－羟基上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5‟→3‟核酸外切酶活性，此酶将缺口5‟侧核苷酸依次切除；

当双链DNA分子的一条链上产生切口时，E.coli DNA聚合酶Ⅰ就可将核苷酸连接到切口的3'羟基末端。同时该酶具有从5'→3'的核酸外切酶活性，能从切口的5'端除去核苷酸。由于在切去核苷酸的同时又在切口的3'端补上核苷酸，从而使切口沿着DNA链移动，用放射性核苷酸代替原先无放射性的核苷酸，将放射性同位素掺入到合成新链中。

最合适的切口平移片段一般为50-500个核苷酸。切口平移反应受几种因素的影响： (a) 产物的比活性取决于[α-32 P]dNTP的比活性和模板中核苷酸被置换的程度。 (b) DNA酶Ⅰ的用量和E.coli DNA聚合酶的质量会影响产物片段的大小。

(c) DNA模板中的抑制物如琼脂糖会抑制酶的活性, 故应使用仔细纯化后的DNA。 本法快速、简便、放射活性均一，可以用来制备各种序列特异的探针，进行基因文库的筛选，基因组DNA和RNA的印迹分析，是最常用的一种DNA探针标记法。

3.2 随机引物法 （randon priming）

是近年来发展的一种较理想的核酸探针标记法。是DNA探针标记的常规方法。所谓随机引物是指含有各种可能排列顺序的寡聚核苷酸片断的混合物，它可与任意核酸序列杂交，起到聚合酶引物的作用。随机引物合成双链探针是使寡核苷酸引物与DNA模板结合，在Klenow酶的作用下，合成DNA探针。通常，产物平均长度为400-600个核苷酸。

利用随机引物进行反应的优点是：

(1) Klenow片段没有5„→3‟外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。

(2) 反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。

(3) 反应产物的比活性较高,可达4×109 cpm/μg探针。

(4) 随机引物反应还可以在低熔点琼脂糖中直接进行。

(5 )缺口平移法相比，用此法标记的DNA探针或cDNA探针比活性显著高于缺口平移法，而且结果较稳定。

3.3 末端标记法

标记寡核苷酸时，通常是在5′端或3′端通过酶促反应加上标记物，称为末端标记。

3.3.1 DNA聚合酶Ⅰ klenow片段3′末端标记法

大肠杆菌DNA聚合酶I经枯草杆菌蛋白酶切割可得到两条多肽链，其中分子量为76kd的大片段称为Klenow片段。该酶具有完整聚合酶I的5‟→3‟聚合酶活性和3‟→5‟核酸外切酶活性，但缺乏5‟→3’核酸外切酶活性。利用Klenow片段可以填补由限制酶消解DNA所产生的3‟凹陷末端。因此，用这种方法可以标记双链DNA的凹陷3‟末端； 用Klenow片段标记末端一般只用一种[α-32P]dNTP，加入反应的[α-32P]dNTP取决于DNA末端延伸的5‟末端序列，具有3‟延伸的DNA末端不能被Klenow片段有效在标记，欲标记这类分子可用T4DNA聚合酶；

通过选择相应标记的dNTP，该法还可以只标记DNA分子的一端。例如，若DNA片段的两个末端分别是Bam H I和Hind III 粘膜端，在反应中只加入[α-32P]dNTP或[α-32P]dGTP，使可选择性标记两末端之一。

3.3.2 T4 DNA聚合酶标记法

在反应体系中缺乏dNTP的情况下，T4 DNA聚合酶具有较强的3′ →5′核酸外切酶活性，这样就会形成3′末端残缺的部分单链DNA片段。当加入dNTP后，其核酸外切酶活性被抑制，它具有的5′→3′DNA聚合酶活性，可对DNA 3′末端进行填空标记。

3.3.3 T4多核苷酸激酶标记法

先用碱性磷酸酶去掉磷酸基团，然后再用T4多核苷酸激酶催化5‟末端标记。

3.3.4 末端脱氧核苷酸转移酶标记法

催化dNTP在单、双链DNA的3′末端多聚化，当二价阳离子存在时，末端脱氧核苷酸转移酶可以把dNTP逐个转移到DNA分子的3′-OH端，形成数十至数百个碱基对的长尾。

3.4 非放射性标记

3.4.1 生物素标记

通过一个连接臂以共价结合方式将生物素连接到UTP或dUTP的嘧啶环C5位置上，形成生物素化的核苷酸。

① 掺入标记法：

生物素标记的dNTP（如11-biotin-dUTP 、16-biotin-dUTP、21-biotin-dUTP）可代替相应的单核苷酸，在DNA聚合酶的作用下，通过随机引物法或缺口平移法，将生物素化核苷酸掺入到DNA分子中，从而获得生物素标记的DNA探针.

② 光敏生物素标记法：

先通过连接臂将一个光敏基团连接于生物素，成为光敏生物素（photobiotin）。

3.4.2 半抗原地高辛配基标记法

将Dig与dUTP（或dCTP、dGTP）相连生成Dig-dUTP复合物，再通过缺口平移法和随机引物法将其掺入到DNA上。用此法标记的探针在-20oC保存，可维持一年有效

3.5 标记探针的纯化

方法有二种：

3.5.1 凝胶过滤层析法

3.5.2 乙醇沉淀法

3.6 结果检测

3.6.1 放射自显影检测杂交信号

3.6.2 非放射性核酸探针的检测

（1）偶联反应

大多数非放射性标记物是半抗原，可通过抗原抗体反应与显色系统偶联。

（2）显色反应

通过连接在抗体或抗生物素蛋白上的显色物质（如酶、荧光素等）进行杂交信号的检测。

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