病毒类疫苗生产过程中的动物细胞培养及其技术发展

　　【摘 要】疫苗是人类有效预防各种传染病的手段，病毒类疫苗在生产过程中需要对相应病毒进行培养，由于病毒是专营宿主细胞内寄生型微生物，所以就要有对相关动物细胞的培养技术涉及其中。本文通过研读《中华人民共和国药典》第三部中预防类生物制品的制造内容，和疫苗生产中细胞培养相关参考文献，对病毒类疫苗生产中的哺乳动物细胞及相关基本培养过程、技术发展进行了阐述。

　　【关键词】病毒类疫苗 生物制品 细胞培养

　　疫苗是将病原微生物（如细菌、病毒等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的自动免疫制剂。根据其所预防的传染病病原体种类不同大致可分为细菌类疫苗和病毒类疫苗两大类。现在在人群中使用的病毒类疫苗，除了乙肝疫苗是通过基因工程方法制得，其他病毒类疫苗生产都需要通过对病毒的培养，而后再经过纯化、浓缩、或灭活或裂解等过程制备。病毒体是一类专营宿主细胞内寄生型微生物，其繁殖需要在其特定的宿主细胞内进行。所以，病毒类疫苗生产过程中对病毒的培养就需要首先培养病毒体能够在其中繁殖的动物细胞。直接感染动物培养病毒存在着不同个体之间的差异，后继纯化程序太过繁琐等缺点，存在一定的安全隐患，所以此种病毒培养方法现在已经基本被淘汰。

　　在2010年版的《中华人民共和国药典》（以下简称《药典》）第三部生物制品类中预防类生物制品共包括48种疫苗，其中病毒类疫苗共有27种，分别针对乙型脑炎、森林脑炎、狂犬病、流感、乙型肝炎、甲型肝炎、脊髓灰质炎、麻疹、腮腺炎、风疹和肾综合征出血热等11种病毒性传染病。在这27种病毒类疫苗的生产工艺过程中，有两种重组乙型肝炎疫苗是使用重组CHO细胞（中国仓鼠卵巢细胞）和重组酵母菌生产乙型肝炎表面抗原蛋白质作为疫苗抗原，其他病毒类疫苗生产中病毒的培养方式全是在动物细胞中，包括，通过原代细胞培养方式、通过人二倍体细胞或Vero细胞培养方式、在鸡胚中培养方式。在相应的病毒接种之前，首先要做的工作就是培养这些动物细胞。

　　1 动物细胞培养一般过程

　　动物细胞培养是指在体外培养活的动物细胞群体，当前，许多生物技术领域都会使用到此项技术。特别是在医药领域的发展，细胞培养更具有特殊的作用和价值。比如疫苗或基因工程药物在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的。动物细胞培养常用的仪器设备包括，无菌室、超净工作台、低温冰箱、pH计、压力蒸气消毒器、电热恒温培养箱、培养器具、CO2培养箱、恒温水浴锅、倒置显微镜、离心机、无菌过滤器、洗刷装置、细胞计数板和电子细胞技术仪等等[1]。细胞培养又可分为原代细胞培养和传代细胞培养。

　　1.1原代细胞培养

　　原代细胞培养是将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖的过程。其基本步骤包括：取材、剪切、消化、分离、计数、培养，在所有的操作过程中，都必须保持培养物及其生长环境的无菌[2]。由于原代培养的细胞转化极性较小，对病毒敏感性好，因此适应制备疫苗。在《药典》第三部病毒类疫苗中，包括利用原代兔肾细胞培养风疹病毒，利用原代猴肾细胞培养脊髓灰质炎病毒，利用原代地鼠肾细胞培养狂犬病病毒、乙型脑炎病毒、肾综合征出血热病毒、森林脑炎病毒，利用原代鸡胚细胞培养麻疹病毒、腮腺炎病毒，利用原代沙鼠肾细胞培养肾综合征出血热病毒。

　　但原代细胞培养也存在着有潜在外源因子、不能事先检查标化、且受供体年龄健康状况的影响而导致批间差异大等缺陷。因此，利用稳定的传代细胞来代替原代细胞培养这些病毒成为未来发展方向。《药典》第三部中，上述的各类病毒的不同毒株也有在人二倍体细胞中培养生产的疫苗，如：风疹病毒BRDⅡ减毒株、脊髓灰质炎病毒Sabin株，还有在Vero细胞中生产的冻干人用狂犬病疫苗、冻干乙型脑炎灭活疫苗等。

　　1.2传代细胞培养

　　传代细胞培养，当原代培养成功以后，随着培养时间的延长和细胞不断分裂，一则细胞之间相互接触而发生接触性抑制，生长速度减慢甚至停止；另一方面也会因营养物不足和代谢物积累而不利于生长或发生中毒。此时就需要将培养物分割成小的部分，重新接种到另外的培养器皿（瓶）内，再进行培养。这个过程就称为传代或者再培养，对单层培养而言，80%汇合或刚汇合的细胞是较理想的传代阶段。疫苗生产中的传代细胞培养是指对稳定细胞系的培养，取出生产指定用的冷冻保存细胞系，经过细胞复苏后进行培养过程。《药典》第三部中规定疫苗生产可利用的传代细胞是人二倍体细胞和Vero细胞。

　　人二倍体细胞株来源于正常人胎儿组织，主要用于培养病毒制备疫苗。用于疫苗生产的细胞株，必须符合相关规程要求。不能含有外源因子，核型正常，对病毒敏感和具有足够多的细胞种子。第一株人二倍体细胞（HDC）WI-38建立于1961年，此后发现狂犬病毒PV株、PM株、HEP株、LEP株都可以在HDC中持续感染。法国于1974年12月批准了人二倍体细胞狂犬病疫苗（HDCV），因为它的高度安全性，HDCV也被WHO（世界卫生组织）推荐为金标准参考疫苗。但是，其生产成本很高，所以通常仅适应于发达国家[3]。

　　Vero细胞是由日本学者Yasumura等于1962年从正常成年非洲绿猴肾分离获得的贴壁依赖性细胞系，它也是WHO和我国认可的疫苗生产细胞系。与用作疫苗生产的原代细胞、二倍体细胞和其他一些传代细胞基质相比，Vero细胞具有以下特点：①来源方便，可连续传代，生长速度快；②对多种病毒的感染敏感、病毒增殖滴度高；⑧遗传性状稳定，恶性转化程度低，生物安全性较高；④培养条件要求不苛刻，易于在生物反应器实施大规模培养。因此Vero细胞也成为众多病毒类疫苗生产科研人员研究对象。有已经应用成功的狂犬病疫苗，处于临床试验期的流感疫苗，还有正处于研发过程中的脊髓灰质炎疫苗、乙型脑炎疫苗等[4、5]。 　　2 流感病毒的培养

　　流感疫苗生产过程中流感病毒的培养是在鸡胚尿囊腔中接种，病毒感染鸡胚尿囊腔上皮细胞培养方式。这种方式也是目前流感疫苗生产最常见的方式。但是，在实际应用中存在不同批次鸡胚供用之间有差异，在流感爆发季节鸡胚供用量无法满足，和生产过程人力劳动量大等不足之处。所以，使用动物细胞培养方式生产流感疫苗就进入了人们视野。WHO也建议使用已经建立的哺乳动物细胞系替代鸡胚进行流感疫苗生产[6]。目前实验使用的细胞有Vero细胞、Madin Darby狗肾细胞（MDCK）等。

　　3 病毒细胞培养的不足与其技术发展

　　由于疫苗使用对象是健康人群和婴幼儿，它的安全性始终是人们所关注的焦点。使用原代细胞培养和使用含有血清培养基培养细胞来生产病毒疫苗存在着不同批次原代细胞或血清之间有差异、易带入外源蛋白因子等一定的安全隐患。因此，现在科学研究一方面致力于寻找适用于细胞系培养的病毒株，另一方面在研究使用无血清培养基培养细胞技术。Vero细胞无血清培养技术已经在狂犬病疫苗生产中成功运用，在流感疫苗生产中运用目前已经处于临床试验期间[4]。另外在细胞大规模生产中使用的生物反应器技术的发展也是病毒类疫苗生产过程中的关键技术。国外推广较多的生物反应器有：美国NBS公司的填充床细胞培养反应器和Wave摇袋式一次性细胞培养反应器[7]。微载体悬浮培养技术已经成为动物细胞大规模生产中较常采用的技术。通过体外表达病毒结构蛋白，在特定状态下可自动装配成在形态上类似于天然病毒的空心颗粒的病毒样颗粒（VLPs），利用此项技术生产疫苗也已经成为病毒类疫苗生产的一种新途径。

　　参考文献：

　　[1] Rajeev Nema， Sarita Khare. An animal cell culture： Advance technology for modern research [J].Advances in Bioscience and Biotechnology， 2012，3，219-226.

　　[2]周珍辉主编.动物细胞培养技术[M].中国环境出版社，2006（08）：01

　　[3]王月，黄思佳.现代狂犬病疫苗生产用细胞和毒种：现状与前景[J].国际生物制品学，2012.vol35.No.5.

　　[4]陈天，陈克平，陈昭烈.Vero细胞无血清培养技术的研究与应用[J].生物技术通讯，2009.vol20.No.3，417-425.

　　[5]王辉，过琴媛，张月兰等.Vero细胞乙型脑炎纯化疫苗生产工艺参数的研究[J].生物学免疫学进展，2006年第34卷第3期.

　　[6]Perdue M L，Arnold F，Li S，et a1.The future of cell culture based influenza vaccine productions[J].EXPERT REV VACCINES.201l.10（8）：1183―1194.

　　[7]李一锋.流感病毒及其疫苗传代细胞制备研究进展[J].生物学，2012年4月，第29卷第2期.

　　作者简介：曹大红，1974年12月，男，江苏徐州人，江苏省徐州医药高等职业学校，生物制药专业教师，讲师，生物化学与分子生物学专业硕士研究生，研究方向：生物制药技术。