人心肌干细胞的体外改良培养
hi ne s e J o ur na I o f P a t ho phy s i o I o g y 2013 29 2 381-384 C
[文章编号] 1000-4718(2013) 02-0381-04
381
~实验技术~
人心肌干细胞的体外改良培养!
胡圣大! 马根山" ! 姚玉宇! 陈中噗! 严凤梯
东南大学附属中大医院心内科 江苏南京210009
[摘 要] 目的:用改良的培养基培养人心肌干细胞 并筛选鉴定 方法:通过心脏外科手术取下右心耳组织 用组织, 培养法来获得原代心肌干细胞 用改良的心肌干细胞培养液培养 增殖传代后进行心肌干细胞表面标志物的鉴定 再用免疫磁珠筛选以获得较纯的目的心肌干细胞 结果:培养约2周后 贴壁良好的心肌组织, 周围c c ut a s e 细胞消化液 短时间消化后冲洗细胞 培养增殖传代 其增殖能力与传统可见有小 圆 亮的细胞爬出 用A
-k i t 干细胞表面标志物 其阳性率 6. 81心肌干细胞培养液培养的细胞比较无显著差异 用流式细胞术鉴定c
+
2. 1 % 之后用含抗c -k i t nt i -c -k i t 的磁珠进行分选 即得较纯的c -k i t -k i t 心肌干细胞 它们可以抗体 a 阳性 c
分化为心肌细胞 结论:通过心脏组织, 贴壁培养法 用改良后的心肌干细胞培养基培养 再借助免疫磁珠的分
+
-k i t 选 同样可得到较纯的c 心肌干细胞
[关键词] 心肌干细胞 流式细胞术 磁珠分选 [中图分类号] R542. 2+2 [文献标志码] A
do i 10. 3969/j . i s s n. 1000-4718. 2013. 02. 035
C u l t u r e of h u m an c ar d i ac s t e m c e l l s w i t hi m p r ove d c ar d i os p h e r e -gr ow i n g
m e d i u m i nv i t r o
~Ushe ng -da M AG e n-s ha n Y A OY u-y u C ~E Nz ho ng -pu Y A Nf e ng -di
D e p ar t m e nt o f C ar di o l o gy t he f f f i l i at e d Z ho ngda H o s p i t al o f so ut he as t u ni u e r s i t y N anj i ng 210009 C hi na. E -m ai l m a-t m ai l . c o m ge ns han @ho
A B S T R A C T A I M T o pr e pa r e a n i m pr o v e d m e di umf o r c uI t ur i ng hum a n c a r di a c s t e mc e I I s . ME T H O D S T he he a r t s a m pI e s o f t he r i g ht a ur i c I e o bt a i ne d f r o mt he pa t i e nt s a f t e r c a r di a c s ur g e r y w e r e m i nc e d i nt o pi e c e s a bo ut 1m mx 1m mx 1m m di g e s t e d a nd c uI t ur e d. T he pr i m a r y c e I I s o bt a i ne d w e r e c uI t ur e d w i t h i m pr o v e d c a r di o s phe r e -g r o w i ng m e di um
+ C G M f o r pr o I i f e r a t i o n a nd t he c e I I s w e r e i de nt i f i e d by f I o wc y t o m e t r y . f i na I I y pur e r c -ki t c e I I s w e r e o bt a i ne d by t he
m e t ho d o f m a g ne t i c be a d s o r t i ng . R E S U L T S A f t e r a bo ut 2w e e ks o f c uI t ur e s m a I I r o und a nd pha s e -br i g ht c e I I s m i g r a t e d f r o mt he w e I I -a dhe r e nt e x pI a nt s o v e r a I a y e r o f f i br o bI a s t -I i ke c e I I s . T he s e c e I I s w e r e c o I I e c t e d by a br i e f di g e s t i o n w i t h A c -c ut a s e w a s he d a nd c uI t ur e d w i t h i m pr o v e d C G M . N o s i g ni f i c a nt di f f e r e nc e o f t he pr o I i f e r a t i v e c a pa c i t y be t w e e n us i ng t r a di -t i o na I C G M a nd i m pr o v e d C G Mw a s o bs e r v e d. A f t e r s ubc uI t ur e a nd pr o I i f e r a t i o n t he i de nt i f i c a t i o n r e s uI t by f I o wc y t o m e t r y s ho w e d t ha t t he po s i t i v e r a t e o f c -k i t s ur f a c e m a r ke r o n t he s e c e I I s w a s 6. 812. 1 %.b y t he m e t ho d o f a nt i -c -k i t m a g -+ne t i c be a d s o r t i ng pur e r c -k i t c a r di a c s t e mc e I I s w e r e o bt a i ne d a nd di f f e r e nt i a t e d i nt o c a r di o m y o c y t e s . C O N C L U S I O N +P ur e r c -k i t c a r di a c s t e mc e I I s a r e i s o I a t e d w i t h t he i m pr o v e d C G M c uI t ur e .
E OR D S Ca r di a c s t e mc e I I s f I o wc y t o m e t r y M a g ne t i c be a d s o r t i ng
一直以来的传统观念都认为哺乳动物的心脏是终末分化器官 心肌细胞是永久性细胞 正常情况下心肌细胞的寿命与个体寿命相同 不能分裂增殖 伴随着疾病和衰老 部分成年心肌细胞丢失 只能通过剩余心肌细胞的肥大和结缔组织的增生纤维化来进行重构代偿 然而 近年来这一观点正逐渐被动摇 认为成年心脏虽是终末器官 但心肌组织中含有
07-03 [修回日期]2012-12-27 [收稿日期]2012-o . 6590000029 ! [基金项目]国家自然科学基金资助项目 N
可以再生的细胞 称之为心肌干细胞 它可以分化为心肌细胞 内皮细胞及平滑肌细胞
1
在人的一生
中 成年心肌细胞不停地衰老死亡 同时由心肌干细胞不断增殖分化为新的心肌细胞 维持心肌细胞数目的动态平衡 保持心脏功能
2-3
病理情况下心肌细胞的丢失量超过其增殖代偿能力 便会出现前述传统观念的变化 因此如何进一
万方数据T e I 025-83272038 E -m a i I m a g e ns ha n@hot m a i I . c o m " 通讯作者
~382~
步促进心肌干细胞的增殖归巢分化便成为当前研究的热点O 而这些研究的基础在于心肌干细胞的培养获得, 本研究旨在探索一条简便实用的培养方法, 为心肌干细胞的进一步研究打下基础O
O 的培养皿中培养, 置于37C ~含5%C2的恒温培养
3d 换l 次培养液O 箱继续培养传代增殖, 2~
2. 3 心肌干细胞的鉴定及纯化 待3~6d 后, 培养c -皿中的细胞基本上生长融合, 且为单层细胞, 用A
c ut a s e 5m i n , 取适量样品, 加入a nt i -c -k i t -P E 消化3~nt i -c -k i t 孵育后行流式细胞术分析, 剩余细胞用a 抗
5]
, 即可得到较多较纯的体吸附的磁珠进行分选[4-
材 料 和 方 法
1 材料
+
T r y ps i n 和c o I I a g e na s e i o s ha r p ; A c -c -k i t V 粉剂购自B 心肌干细胞O c ut a s e i I I i po r e ; 无菌磷酸盐缓冲液(pho s pha t e 2. 4 心肌干细胞的增殖和分化测定 利用C C k -8购自M
buf f e r e d s a I i ne , P B S )~胎牛血清~L -谷氨酚胺~青霉素(C e I I C o unt i ng k i t -8) 来测定细胞增殖能力, 细胞接
链霉素双抗~I M D M 和D M E M/F l2培养液均购自H y -C I o ne ; B -琉基乙醇购自Suns hi ne ; 血管内皮生长因子(v a s c uI a r e ndo t he I i a I g r o w t h f a c t o r , V E G F ) 和碱性成纤维细胞生长因子(ba
s i c f i br o bI a s t g r o w t h f a c t o r , bF G F ) 购自Si g m a ; a nt i -c -k i t m i c r o be a ds 和a nt i -c -k i t -P E 购自M
i I t e ny i B i o t e c ; 恒温细胞培养箱购自T he r m o ; 恒温振荡仪购自太仓市科教器材厂O 2 方法
2. 1 取村和培养 心脏外科手术过程中(患者年龄2~72岁; 心脏疾病有Z 冠心病~瓣膜病和先心病), 在情况许可的条件下, 取右心耳组织数克O 用不含钙~镁的无菌P B S 冲洗掉血液, 去掉脂肪组织后剪成大小l m
mX l m m X l m m 左右的小块, 然后移入离心管加入适量0.
2%胰蛋白酶和0. l%胶原酶I V 的混合液, 37C 振荡消化5m
i n , 移去消化液, 重复3次O 处理后的组织块用完全组织块培养液(c
o m pI e t e e x -pI a nt m e di um , C E M ; 以I M D M 为基础, 含20%胎牛血清~2m m o I /LL -谷氨酚胺~l X l05
U /L 青霉素~l00m g /L 链霉素和0. l m m o I /L B -琉基乙醇) 冲洗l ~2次后移入到6孔板中并使其均匀分散O 加入少量
C E M (约0. 5m L 左右), 保持组织块湿润即可, 置于37C ~含5%CO 2的恒温培养箱中贴壁O 8~
l2h 后加入l ~
l. 5m L 的C E M , 继续前述条件培养, 2~3d 换l 次培养液O
2. 2 心肌干细胞的收集培养 通常3~7d 的时间内, 贴壁良好的心肌组织块周围可见到先有长梭形的成纤维细胞爬出, 之后数天即可见在其上面爬出的小~圆~亮的细胞, 当有较多的此类细胞时, 即用A c c ut a s e 消化(约2m
i n 即可), 之后加入少量改良的心肌干细胞培养液(i
m pr o v e d c a r di o s phe r e -g r o w i ng m e di um , i m pr o v e d C G M ; 以D M E M/F l2为基础, 含
l0%胎牛血清~2m m o I /LL -谷氨酚胺~l X l05U /L 青霉素~l00m g /L 链霉素和0. l m m o I /L B -琉基乙醇,
较之传统的C
G M , 减少了V E G F 和bF G F 2种细胞因子), 轻柔万方数据
地冲洗数次, 将冲洗后的混合液移入6c m 种于96孔板, 每孔约3X l03细胞, 分别用传统的C G M 和不含V E G F 和bF G F 的C G M 进行培养, 3d 后各l6个孔在450nm 处测定A 值, 所得数据间接
表示细胞的量, 所有步骤严格按试剂盒说明进行O 开胸结扎前降支制作裸鼠心梗模型后, 经心外膜注射心肌干细胞, 4周后取心肌组织进行组织免疫荧光染色鉴定心肌干细胞的分化情况O 3 统计学处理
采用SP SS l8. 0软件分析, 数据以均数1标准差
(m e a n 1SD ) 表示, 组间比较采用I 检验O
结 果
1 组织块的培养
贴壁好的组织块周围, 早的3d 后即可看见周围有梭形的成纤维细胞爬出, 最晚的l 周左右也可以
爬出, 否则通常不再会有细胞爬出O 成纤维细胞爬出后3d 左右在其上面即可以出现小~圆~亮的细胞,
以后逐渐增多, 见图l
O F i g ur e l.P r i m a r y c a r di a c s t e mc e I I s c uI t ur e d f r o mt i s s ue bI o c ks
(X l00) . L o w e rI e f tc o r ne r Z m y o c a r di a It i s s ue bI o c ks . T he a r r o w s s ho ws m a I I , r o und a nd br i g ht pr i -m a r y c a r di a c s t e mc e I I s , w hi I e t he t r i a ng I e s r e f e r t o t he f i br o bI a s t s .
图1 组织块培养的原代心肌干细胞
2 心肌干细胞的获得’培养及纯化鉴定
待小~圆~亮的细胞出现较多后即可消化冲洗下
-383-
来移入培养皿培养增殖, 此时部分卜肌干细胞贴壁后空间不受约束, 胞质会向外伸展而形成梭形~多边形或不规则异形等形状, 见图2O 不同年龄及疾病患
-k i t 者细胞的c 阳性率是不一样的, 总体上未分选细-k i t 18%(6. 8%12. 1%>,见胞c 的阳性率约2%~
+-k i t 图3O 经磁珠分选后即可得到一定量的较纯的c -k i t 卜肌干细胞, c 阳性率可超过80%O 所得细胞可
80C 较长时间保存(更长时间保存应保存于液于-氮中>,且复苏后仍具有干细胞活力O 3 心肌干细胞的增殖和分化
C k -8法我们测定了细胞的增殖能力, 均利用C
G M 培养组和不含直接用C 值表示细胞的量, 传统C
V E G F 及bF G F 的C G M 组C 值分别是0. 15610. 01314910. 011, 两组间差异无统计学意义(D >和0.
0. 05>O体内卜肌干细胞的分化实验明确其可以分
化为卜肌细胞, 见图4
O
F i g ur e 2.t he s e c o nd g e ne r a t i o n o f c a r di a c s t e mc e I I s (X 200>. 图2 传至第2代的呈球形的心肌
干细胞
F i g ur e 3.F I o wc y t o m e t r i c i de nt i f i c a t i o n o f c a r di a c s t e mc e I I s . A :c o nt r o I ; B :I a be I e d w i t h a nt i -c -k i t -P Ef I o wc y t o m e t r y a nt i bo dy a nd
t he c -k i t po s i t i v e r a t e w a s 8. 44%.
图3 消化下的第2代心肌干细胞的流式细胞术
鉴定
讨 论
-k i t ~i s I 1常用于鉴定卜肌干细胞的表面标记有c
8]
a -1等 6-, 本实验室测得Sc a -1阳性的细胞数和Sc
4%(由于市面上暂无用于测人干细胞的比例仅1. Sc a -1, 考虑到可能的交叉反应, 遂试用抗小鼠的a nt i -Sc a -1, 同时测得小鼠卜肌干细胞的Sc a -1阳性率1. 8%, 较之人无显著差异>O而用a nt i -i s I 1则几6无阳性表达, 加之文献报道认为从人卜肌组织中分离
+ 6]
-k i t 的c 细胞即为卜肌干细胞, 故我们实验室最
-k i t 为卜肌干细胞的待测表面标志O F i g ur e 4.i de nt i f i c a t i o n o f t he di f f e r e nt i a t i o n o f c a r di a c s t e mc e I I s 终确定选定c
9]
e s s i na 本研究采用M 等的组织块培养法获取us i ng t i s s ue i m m uno f I uo r e s c e nc e t e c hni gue (X 200>.
R e d f I uo r e s c e nc e s ho w s s t a i ni ng o f m y o c y t e c y t o pI a s m 原代细胞, 该方法避免了长时间多次酶消化对细胞
造成的损伤, 在大大减少了杂细胞的同时也最大限s ho w s nuc I e i ; g r e e n f I uo r e s c e nc e s ho w s I o c a I i z a t i o n o f 度地使用了卜肌组织块, 可以反复多次地从组织块m i t o c ho ndr i a . 周围消化下所需的细胞O 对于小~圆~亮的细胞采用万方数据A c c ut a s e G M 轻柔冲洗2~短时间消化后用改良的C 图4 心肌干细胞的分化鉴定
bys a r c o m e r i c ! -a c t i n a nt i bo dy ; bI ue f I uo r e s c e nc e
384
3次 用力较大则会将组织块冲下 其获取细胞的效
a ng -h a nks 率比T 等[10]报道的D 液冲洗法要高很多 c c ut a s e 而且A 作用较温和 对所得细胞的活性及表
-k i t 面标志影响均不大 c 的阳性率与国外文献报道G M 中均的一致[1] 本实验室前期的细胞培养液C
G F 和DF G F 在本研究的细胞培养中 我们加入了E
G F 和DF G F 的改良C G M 发现细尝试着使用未加E
胞的增殖活力在通常情况下并没有发生明显的改
6d 即需传代分瓶 之变 用于培养细胞的培养皿3~
-k i t 后的流式细胞术分析鉴定c 的阳性率没有明显
参 考 文 献
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的差异[1]
实验中还有几个关键点:首先是组织块的初次加液量与贴壁时间的掌握 时间短加液过多均导致组织块未贴壁好 细胞无法爬出 时间久加液少 培养液干涸组织块细胞死亡; 其次是初次消化细胞时间的掌握 过短细胞消化不下来 过久会消化下贴壁较牢的成纤维细胞 致使杂细胞过多 为后续的实验增加工作量 甚至影响心肌干细胞的增殖分化 由
于所得原代细胞数量较少(若是单用D -h a nks 冲洗 所得细胞数量更少) 若直接用磁珠分选细胞 首先
会浪费磁柱的利用率; 其次加之操作过程中丢失及破坏的细胞 最后所得目的细胞已所剩无几 故而
本实验室在取得原代细胞后 先经3~
6d 的增殖后再进行磁珠分选 得到目的细胞的数量大大增加
总之 本实验室采用组织块贴壁培养法 成功地获得原代心肌干细胞后 未加E
G F 和DF G F 的改良细胞培养液也成功地运用于心肌干细胞的培养 这种改良的细胞培养液对干细胞的增殖分化能力及c -k i t 的表达未产生明显的影响 但却大大减少了细胞培养的实验费用 培养获得的心肌干细胞可用于进一步的研究 以期最终能够解决临床问题
(y z 感谢东南大学附属中大医院心胸外科刘志勇
教授和何伟博士提供的人心肌组织块D)
万方数据
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人心肌干细胞的体外改良培养
作者：作者单位：刊名：英文刊名：年，卷(期)：
胡圣大， 马根山， 姚玉宇， 陈中璞， 严凤娣， HU Sheng-da， MA Gen-shan， YAO Yu-yu ， CHEN Zhong-pu， YAN Feng-di
东南大学附属中大医院心内科,江苏,南京,210009中国病理生理杂志
CHINESE JOURNAL OF PATHOPHYSIOLOGY2013,29(2)
本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgblslzz201302035.aspx