琼脂糖凝胶电泳检测DNA
琼脂糖凝胶电泳检测DNA
(agarose gel electrophoresis)
目的和要求
学习和掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作
实验原理
1. 琼脂糖凝胶电泳是最常用的鉴定DNA的方法，基本原理与蛋白质电泳相似：简便易行，只需少量DNA
2. 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度
3. DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时具有电荷效应与分子筛效应，迁移速率与其相对分子质量的对数反相关
4. 琼脂糖凝胶中的DNA可利用荧光染料GoodView染色并在在紫外灯照射下观察
主要试剂和器材
一、试剂
50ⅹTAE缓冲液(pH8)； 凝胶上样缓冲液(0.2%溴酚蓝，50%蔗糖) GoodView (溴化乙锭EB替代物)； 琼脂糖
二、器材
电泳仪、水平电泳槽、紫外检测仪
基本操作方法
1. 琼脂糖凝胶制备：
称取0.45g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入30ml TAE缓冲液，保鲜膜封口，置微波炉加热至完全澄清透明取出摇匀(琼脂糖浓度为1.5%)；
待凝胶溶液冷却至50℃(不烫手)，加入3ml GoodView (终浓度0.5g/ml)
2. 凝胶板制备：
用制胶器将紫外透光凝胶盘固定好，采用水平仪调整平衡使凝胶盘位于同一水平面；
将适宜的梳子垂直架在凝胶盘内槽的一端；
将冷却至50℃的琼脂糖凝胶缓缓倒入凝胶盘内槽，厚度适宜(不要有气泡)
3. 点样：
待凝胶凝固后，小心取出梳齿，将凝胶盘放入电泳槽內，加入足够的TAE电泳缓冲液，使液面略高出凝胶面；
取5微升PCR扩增产物，向其中加入1微升的上样缓冲液，混匀后用移液器将其加入加样孔，记录样品点样次序与点样量
4. 电泳：
接通电泳槽与电泳仪的电源，调节电压90V，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停止电泳
5. 观察：
在紫外灯下观察凝胶，有DNA处应显出荧光条带，记录电泳结果
注意事项：
1. 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使凝胶盘变形
2. 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔
3. 点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡
思考题
DNA在电场中的迁移率取决于哪些因素？