羧甲基化香菇多糖对壳聚糖表面的化学修饰

第27卷第8期 2011年8月

高分子材料科学与工程

POLYMER MATERIALS SCIENCE AND ENGINEERING

Vol. 27, No. 8

Aug 2011

羧甲基化香菇多糖对壳聚糖表面的化学修饰

王艺峰, 徐 敏, 洪群峰, 连鑫鑫

(武汉理工大学材料科学与工程学院, 湖北武汉430070)

摘要:以壳聚糖为基材, 通过表面化学接枝修饰的方法, 将羧甲基化香菇多糖固定在壳聚糖基材的表面。通过红外光谱、水接触角测试、抗菌活性及蛋白质吸附等测试方法对修饰后的壳聚糖表面性能进行了表征和分析。测试结果表明, 经过表面接枝修饰的壳聚糖基材表面的亲水性得到明显改善, 表面纤维蛋白原的吸附量降低了61%, 显示出明显的排斥蛋白质非特异性吸附的效果; 然而, 经过修饰后的壳聚糖表面对大肠杆菌的抑制率有一定程度的降低。关键词:壳聚糖; 表面修饰; 真菌多糖; 羧甲基化香菇多糖; 生物医用材料

中图分类号:O636. 1 文献标识码:A 文章编号:1000-7555(2011) 08-0109-04

壳聚糖是一种带有氨基的生物多糖, 具有无毒性、生物降解性、抗菌活性等优点被应用于生物材料领域。然而, 壳聚糖材料会增加血浆蛋白质的吸附、血小板粘附和活化, 从而导致血栓形成[1, 2], 这严重制约其作为与血液相接触生物材料的应用。近年来, 通过在材料表面固定多糖衍生物) ) ) 羧甲基化多糖, 制备具有排斥蛋白非特异吸附的/抗污染0表面的研究引起了人们的关注[3, 4]。值得注意的是, 来源于真菌的香菇多糖及其衍生物显示出十分显著的抗肿瘤、免疫调节、抗

[5]

菌、抗凝血等多方面的生物活性, 这些特殊的生物活性对于被修饰材料具有潜在的应用价值, 可以大大拓展生物材料的功能和用途。目前, 虽然已有研究者开展了利用生物多糖类物质例如肝素、葡聚糖硫酸酯、海藻酸等进行壳聚糖生物材料表面修饰, 改善其血液相容性等表面性能的研究, 然而利用具有生物活性的香菇多糖羧甲基衍生物进行生物材料表面修饰的研究还未见报道。1 实验部分

1. 1 主要试剂与原料

壳聚糖:脱乙酰度\90. 0%, 国药集团化学试剂公司; 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐:EDC. H Cl, Shanghai Medpep Co. , Ltd. ; 大肠杆菌(Es -125cherichia coli) :中国典型培养物保藏中心; I:ICN Pharmaceuticals, Irv ine; 纤维蛋白原(Fibrinogen, Ca-l

[2, 6]

biochem) ; 白蛋白(Albumin, Sigma) 。1. 2 羧甲基化香菇多糖的制备

香菇多糖采用0. 5mol/L NaOH 从香菇子实体(湖北房县产) 中提取。在冰浴中将016g 香菇多糖分散于10mL 20%NaOH 和25mL 异丙醇混合液中, 搅拌后形成均匀悬浮液, 再将5125g 氯乙酸溶于10mL 20%NaOH 和25mL 异丙醇混合液中, 先将一半混合液缓慢滴加到反应体系中, 在室温下搅拌反应3h, 再将反应液升温至60e , 继续搅拌30min 后滴加另一半混合液, 在60e 继续反应1h, 停止反应后冷却至室温, 调节反应液pH 至中性。将所得反应液注入再生纤维素透析袋中, 经自来水透析5d, 蒸馏水透析4d 后旋转蒸发浓缩, 最后冷冻干燥得到白色粉末状羧甲基化香菇多糖(CL) 。

1. 3 羧甲基化香菇多糖对壳聚糖基材的表面化学修饰

将壳聚糖溶于2%的乙酸溶液中, 搅拌至充分溶解, 再将壳聚糖溶液倒入平底成膜盘内, 38e 干燥24h 得到壳聚糖膜, 然后将壳聚糖膜切成直径为710mm 、厚为015mm 的圆形膜片, 得到壳聚糖膜基材(CS) 。将羧甲基化香菇多糖溶于去离子水中, 配成质量分数1%的多糖溶液, 加入EDC #H Cl(质量分数1%) 和NHS(质量分数1%) , 调节pH 至510, 反应30min, 然后将多糖溶液的pH 调节至中性, 加入CS 膜片, 常

收稿日期:2010-10-25

基金项目:国家自然科学基金面上项目(50703030) 通讯联系人:王艺峰, 主要从事生物医用高分子材料、蛋白质选择性分离材料及天然高分子材料的研究, E -mail:yifengwan@w hut. edu. cn

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温搅拌反应24h 。反应完毕后用去离子水清洗膜片4次~6次, 38e 干燥48h, 即制备得到表面修饰的壳聚糖膜片(CS -CL) 。

1. 4 测试分析

1. 4. 1 红外光谱测试:将香菇多糖、羧甲基香菇多糖、壳聚糖和羧甲基化香菇多糖表面修饰的壳聚糖膜片分别采用红外光谱仪(Nexus, 美国Thermo Nicolet) 进行测试, 在400cm -1~4000cm -1波长范围内扫描。1. 4. 2 水接触角测试:用接触角测试仪(JJC -I, 长春第五光学仪器厂) 测定膜表面的水接触角, 将2L L 的去离子水滴在待测膜片表面, 待稳定后测膜片与水滴的左右两个夹角, 每个样品测量6次。

1. 4. 3 抗菌性能测试:大肠杆菌抗菌活性测试按照中华人民共和国轻工行业标准5抗菌塑料-抗菌性能测试方法和抗菌效果6执行。选择菌液浓度为(510~1010) @105cfu/mL 的稀释液作为试验用菌液, 按照GB 4789. 25食品卫生微生物学检验菌落总数测定6的方法操作, 在每个培养管中加入2m L 菌液, 分别加入5片表面修饰前后的壳聚糖膜片, 而空白对照组不加入膜片, 在37e 恒温振荡培养24h, 用平板计数法计算出菌落数目。每组数据做两次平行实验, 每个样品做三个平行抗菌测试。

1. 4. 4 蛋白质吸附性能测试:先将纤维蛋白原和白蛋白分别进行125I 定量标记, 再将125I 标记与未标记的被测蛋白质按1B 19配成1mg/mL 的缓冲液。将样品浸泡于T BS 缓冲液中平衡12h, 然后将膜片转移至含0125mL(1mg/mL) 被测蛋白质的96孔板中, 室温浸泡2h~3h 后, 用TBS 缓冲液清洗3次, 每次10min, 用滤纸吸干膜表面的水分, 转入stock 管并放入伽马计数器(Wizard 3c c 1480, 美国Perkins Elmer) 中对膜片的放射量进行测定并计算膜片表面蛋白质的吸附量。每组数据做两次平行实验, 每个样品取3片进行平行测试, 其误差值为标准偏差。2 结果与讨论

2. 1 羧甲基化香菇多糖的制备及在壳聚糖表面的化学接枝

由Fig. 1中可以发现, 与香菇多糖红外谱图相比较, 羧甲基化香菇多糖在1598cm 处出现明显的吸收峰, 它归属于-COO -振动峰(以Na 盐的形式存在移向低波数) , 而在1426cm -1处出现的吸收峰归属于-CH 2-的振动峰, 以上红外谱图结果表明本文得到了羧甲基化香菇多糖衍生物。

, -1

提下实施表面修饰是改善材料的表面生物性能的一种重要而且相对实用的手段。多糖类物质是来源于生命体的生物大分子, 具有良好的生物相容性和亲水性, 因此利用多糖类生物大分子进行表面修饰是改善生物材料表面性能的有效途径之一。本工作选择羧甲基化香菇多糖作为壳聚糖基材表面修饰的活性物质。首先, 香菇多糖及其衍生物表现出显著的抗肿瘤、免疫调节、抗菌等多方面的生物活性。其次, CL 具有带负电的羧基, 用它进行壳聚糖的表面修饰可以构筑带有负电荷的表面, 有利于改善材料的血液相容性。此外, 对香菇多糖进行羧甲基衍生化修饰能够引入反应活性基团羧基, 使得表面化学接枝反应更容易进行, 可以在EDC. HCl 的存在下通过与壳聚糖上的-NH 2基的缩合反应进行表面接枝修饰, 从而将CL 固定在壳聚糖基材表面, 方案如Fig. 2所示。

Fig. 1 FT -IR Spectra of Lentinan and CL

Fig. 2 S chematic Diagram of CL Immobilization on Chitosan

S urface

Fig. 3 FT -IR Spectra of CS and CS -CL

从Fig. 3中可以看出, 相对于原壳聚糖的红外光谱, CS -CL 的红外谱图在1735cm -1和1414cm -1处分别

第8期王艺峰等:羧甲基化香菇多糖对壳聚糖表面的化学修饰111

出现了吸收峰, 它们分别对应于CL 上的羧基和亚甲基的振动峰, 这表明羧甲基化香菇多糖已经接枝到了壳聚糖表面。从Fig. 4可以看出, 经过化学修饰后壳聚糖膜片的水接触角由74b 下降到31b , 水接触角发生了明显的降低, 这表明采用化学接枝的方法将羧甲基化香菇多糖固定在壳聚糖表面后能有效改善其亲水性, 而表面亲水性的增加有利于提高生物材料的生物

相容性。

吸附量比值降低, 有利于减少血小板在材料表面的粘附。

羧甲基化香菇多糖的结构中具有带负电荷的羧基, 由于静电排斥作用, 带负电荷的表面能够减少带负电荷的血液成分如蛋白质、血小板、血球等的非特异性吸附, 有利于提高材料表面的抗血栓性能。此外, 聚乙二醇(PEG) 是一种被广泛用于生物材料表面修饰的物质, 由于PEG 大分子具有高亲水性、分子链的运动性等特点, 能够有效排斥材料表面与蛋白质的非特异性吸附, 从而改善材料的生物相容性。同样, 有关文献报道羧甲基多糖也具有与PEG 分子类似的高亲水性、分子链的运动性等特点[3, 4], 这也是CL 能够有效减少材料表面对蛋白质非特异性吸附的原因之一。

Fig. 4 Water Contact Angle of CS and CS -CL

Surface

Fig. 6 The Viable Cell Number of Escherichia Coli after Incubat -ing for 24h

Fig. 5 Fibrinogen and Albumin Adsorption to the Surface of CS

and CS -CL

2. 3 抗菌活性

Fig. 6显示了经表面化学接枝前后的壳聚糖膜片对大肠杆菌的抑菌效果。由图中可以看出, 经化学接枝后的壳聚糖膜表面的大肠杆菌的数量增加, 这表明经过表面修饰后的壳聚糖对大肠杆菌的抑制率发生一定程度的降低。壳聚糖具有广谱抗菌活性, 壳聚糖分子中的-NH 2在表面形成的-NH 3离子, 而-NH 3是壳聚糖产生抗菌活性的必需的活性功能基团, 因此壳聚糖表面的-NH 2数量对于其抗菌活性具有重要的影响。本工作中采用CL 进行壳聚糖的表面修饰时, 由于一部分壳聚糖表面的-NH 2与羧甲基化香菇多糖的-COOH 发生反应, 因而其表面的-NH 2数量减少, 这可能是导致抗菌活性发生一定程度降低的原因。3 结论

本工作通过表面化学接枝方法将羧甲基化香菇多糖固定在壳聚糖基材表面, 测试结果表明, 经表面修饰后的壳聚糖亲水性得到明显提高, 并且显示出明显的排斥蛋白质非特异性吸附的效果, 对纤维蛋白原的吸附量降低了61%, 然而, 经过修饰后的壳聚糖表面对大+

+

2. 2 蛋白质的吸附性能

当生物材料与血液表面接触时, 各种血浆蛋白质会不同程度地迅速吸附到材料表面形成蛋白质吸附层, 吸附层中蛋白质的类型和数量对后续的凝血过程和程度起着决定性的作用。其中, 纤维蛋白原在血浆中含量丰富, 纤维蛋白原在材料表面吸附易于引起血小板的粘附, 进而诱发血栓的形成。由Fig. 5可以看出, 经过化学接枝的CS -CL 表面可以有效降低纤维蛋白原的吸附, 与未修饰的CS 相比, 纤维蛋白原在表面的吸附量降低了61%; 并且经过化学接枝的CS -CL 表面的白蛋白吸附量减少。以上结果表明, 经过CL 接枝修饰后的壳聚糖表面显示出明显的排斥蛋白质非特异性吸附的效果。此外, 未修饰的CS 表面的纤维蛋白原和白蛋白的吸附量比值为413, 而CS -CL 表面纤维蛋白原和白蛋白的吸附量比值为311, 因此CS -CL 表面的纤维蛋白原和白蛋白的吸附量比值要低于它们

在

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S urface Modification on Chitosan S ubstrate Using Carboxymethylated Lentinan

Yifeng Wang, Min Xu, Qunfeng Hong , Xinxin Lian

(School o f Materials Science and Engineer ing , W uhan Univer sity of Technology , Wuhan 430070, China) ABSTRAC T:In this w ork, carboxy methylated lentinan w as covalently immobilized onto the surface of chitosan, in order to im prove the biolog ical performances of the chitosan substrate. The modified chitosan surface w as measured by Fourier transform infrared spectrum (FT -IR) and the w ater contact angle measurement. The fibrinogen and albu -m in adsorption to the surface, and in vitro antibacterial activity against Escherichia coli were evaluated. The water contact angle measurement indicates that the hydrophilicity of chitosan surface increases after modification. The pro -tein adsorption results sug geste that the surface immobilization of carboxymethylated lentinan clearly reduces the non -specific protein adsorption, the fibrinogen adsorption of the modified surface decreases 61%.H ow ever, the antibacte -rial activity against Escherichia coli of the modified chitosan has declined.

Keywords:chitosan; surface modification; fung al polysaccharide; carboxymethylated lentinan; biomedical material

(上接第108页。continued from p. 108)

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Morphology and Oxygen Barrier Properties of Layered HDPE/PA6

Blends Through Two -Step Approach

Yingying Dai, Jiang Li, Shaoyun Guo

(State K ey L aboratory o f Poly mer Materials Engineer ing , Poly mer Research

Institute o f Sichuan Univer sity , Chengdu 610065, China)

ABSTRAC T:Microlayer coextrusion w as employed to produce the continuous and alternating microlayered high dens-i

ty polyethylene (HDPE) /polyamide 6(PA6) blends in the first -step processing. In the second step after g ranulation, microlayered H DPE/PA6pellets were mold -compressed and min-i injected at both 200e and 250e to manufacture final products to produce HDPE/PA6layer blends. In order to study the influence of second -step processing condition on the morphology and ox ygen barrier properties of HDPE/PA6layer composites, SEM observation and ox ygen per -meability of the resulted samples w ere carried out. Microlayer pellets being hot -pressed at 200e or min-i injected at 250e , the orig inal PA6laminas w ith high aspect ratio can be retained or reformed w ell under the shearing force of injection, and the oxygen barrier property of resulting products is improved by 21folds or 43folds in comparison w ith conventional blends due to the elongation of the pathway throug h which oxygen molecules have to penetrate. Keywords:H DPE; PA6; microlayer coex trusion; layer blends; barrier properties