2015年版中国药典微生物限度检查方法验证方案

人工牛黄甲硝唑胶囊微生物限度检查方法验证方案

下表用于记录修订/变更主要内容及历史。

目 录

1. 概述

2. 验证目的和范围 3. 组织及职责 4. 验证进度计划表

5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 7. 验证项目和验证方法 7.1试验菌株

7.2需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备 7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法 7.4需氧菌总数检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 7.5控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法 8. 偏差与漏项控制 9. 验证报告会审

1. 概述

我公司生产品种人工牛黄甲硝唑胶囊，产品微生物限度检查项目为需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数、以及大肠埃希菌检查和沙门菌检查。参照《中国药典》2015版四部附录1105：微生物计数法，以及1106：控制菌检查法的规定，本公司对该产品的微生物限度检查方法予以验证。通过验证以确认所采用的微生物限度检查方法适用。

人工牛黄甲硝唑胶囊处方中含有甲硝唑、人工牛黄以及常用辅料成分，文献资料介绍甲硝唑对细菌有抑菌特性，对霉菌和酵母菌无抑菌活性。甲硝唑在水中微溶，可以通过离心沉淀-薄膜过滤法去除其对微生物生长的影响。本验证方案通过试验菌株的回收率测试，首先确认常规倾注平皿法是否适用于本品的微生物限度检查；如常规倾注平皿法不适用，则进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的微生物限度检查。

本验证方案根据样品特性制定微生物限度检查方法和检验条件，按制定的方法进行试验，根据验证结果判断是否符合验证标准。 2. 验证目的和范围

验证该产品的微生物限度检查方法的适用性，对其有效性进行评价，保证检验结果的可靠性。本验证方案采用3批按GMP 要求组织生产的人工牛黄甲硝唑胶囊，进行微生物限度检查方法的验证。 3. 组织及职责

3.1验证方案和验证报告的起草、审核、批准

验证方案由质量部QC 组负责起草，由质量部审核，最终由质量负责人批准。验证方案实施完成后，由QC 组负责汇总微生物限度检查法验证的结果、撰写报告，由质量部审核，最终由质量负责人批准报告。 3.2验证方案的培训

验证方案在经质量负责人批准后，，由QC 组组长对本次验证实施的相关人员组织培训工作，并将该次的培训记录归档。

3.3验证方案实施过程中的变更和偏差

验证方案实施过程中如有变更和偏差，质量负责人应当组织进行评估并采取相应的控制措施。 3.4 验证工作小组成员表

4. 验证进度计划表

本次微生物限度检查方法验证的计划安排时间是2015年12月至2016年1月。 5. 验证所需要的仪器设备及相关文件的确认

5.1. 主要检验仪器设备确认表

检查人/日期： 复核人/日期： 5.2. 验证所需文件的确认表

检查人/日期： 复核人/日期： 6. 验证所需要的菌种、培养基、检验样品的确认 6.1. 试验菌种检查表

检查人/日期： 复核人/日期： 6.2试验所需的培养基检查

检查人/日期： 复核人/日期：

6.3. 检验样品确认表

检查人/日期： 复核人/日期： 7. 验证项目和验证方法 7.1试验菌株

人工牛黄甲硝唑胶囊需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证所用的菌株为金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉；控制菌检查方法验证所用的菌株为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。

7.2 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证的菌液制备

分别接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至10ml 胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24小时，取此培养液1ml 加0.9％无菌氯化钠溶液9ml ，采用10倍递增稀释法，稀释至10～10, 制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。

接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml 沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3天，取此培养液1ml 加0.9％无菌氯化钠溶液9ml ，采用10倍递增稀释法，稀释至10～10，制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。

接种黑曲霉的新鲜培养物至沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20～25℃培养5～7天，直到获得丰富的孢子。加入3～5ml 含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，吸至无菌试

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管中，取1ml 加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液9ml ，采用10倍递增稀释法，稀释至10-5～10-7，制成50～100cfu/m的孢子悬液备用。

菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃ ,在验证过的贮存期内使用。

验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。

7.3. 需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法 7.3.1. 供试液的制备

取供试品10g ，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml ，振摇，制成1：10的供试液。

7.3.2. 试验组

取1：10的供试液1ml 和7.2项下制备的50～100cfu 的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml 混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。

另取1：10的供试液1ml 和7.2项下制备的50～100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基20ml 混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。 7.3.3. 供试品对照组

取1：10的供试液1ml 注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml 混匀，平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养5天，点计菌落数。

另取1：10的供试液1ml 注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml 混匀，平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。 7.3.4. 菌液对照组

取0.9%无菌氯化钠溶液1ml 和7.2项下制备的50～100cfu 的试验菌，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基20ml 混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置30～35℃培养箱中培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。

另取0.9%无菌氯化钠溶液1ml 和7.2项下制备的50～100cfu 的白色念珠菌、黑曲霉，分别注入平皿中，立即倾注不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基培养基20ml 混匀，每株试验菌株平行制备2个平皿。置20～25℃培养箱中培养5天，点计菌落数。 7.3.5. 常规倾注平皿法方法验证的接受标准

试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率) 应在0 .5〜2 范围内。

7.3.6. 常规倾注平皿法方法验证的结果

7.3.6.1. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数方法验证结果 试验次数1：

人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单

胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天

试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数2：

人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单

胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天

试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数3：

人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单

胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天

试验人/日期： 复核人/日期： 7.3.6.2. 常规倾注平皿法测定霉菌与酵母菌总数方法验证结果

试验次数1：

人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天

试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数2：

人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天

试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数3：

人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；沙氏葡萄糖琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：5天

试验人/日期： 复核人/日期： 7.3.7. 常规倾注平皿法测定需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数方法验证小结

按照验证方案的要求进行试验，若各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，则可确认常规倾注平皿法适用于本品的需氧菌总数、霉菌与酵母菌总数检查。如常规倾注平皿法适用于霉菌与酵母菌总数检查，但不适用于需氧菌总数检查，则下面进一步验证可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法是否适用于本品的需氧菌总数检查。

7.4. 需氧菌总数检查—离心沉淀-薄膜过滤法 7.4.1. 供试液的制备

取供试品10g ，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml ，振摇，制成1：10的供试液贮备液。取1:10的供试液贮备液50ml ，经500转/分钟离心3分钟，取上清液得供试液。 7.4.2. 试验组

取供试液1 ml，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm 混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次（100ml/次），然后在第3次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入7.2项下制备的50～100cfu 的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。 7.4.3. 供试品对照组

取供试液1 ml，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm 混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次），平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养5天，点计菌落数。 7.4.4. 菌液对照组

取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml ，200ml 通过薄膜（孔径0.45μm 混合纤维素膜）后，在余下的100ml0.9%无菌氯化钠溶液中加入7.2项下制备的50～100cfu 的试验菌，过滤。每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。

7.4.5. 稀释剂对照组

依照7.2项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将各菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，然后以500转/分钟离心3分钟，取上层菌液作下面的试验。

取上层菌液1 ml，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm 混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次），每株试验菌株平行制备2张滤膜。取出滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂培养基平皿上，30～35℃倒置培养3天（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌），或培养5天（白色念珠菌、黑曲霉），点计菌落数。 7.4.6. 离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的接受标准

试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值(即试验菌的回收率) 应在0 .5〜2 范围内，同时稀释剂对照组与菌液对照组菌落数的比值应也在0 .5〜2 范围内。 7.4.7. 离心沉淀-薄膜过滤法测定需氧菌总数方法验证的结果 试验次数1：

人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单

胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天

试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数2：

人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单

胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天

试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数3：

人工牛黄甲硝唑胶囊批号: ；胰酪大豆胨琼脂培养基配制批号： 培养箱 型号 编号 ；培养温度： ；培养时长：金黄色葡萄球菌、铜绿假单

胞菌、枯草芽孢杆菌3天，白色念珠菌、黑曲霉5天

试验人/日期： 复核人/日期： 7.4.8. 离心沉淀-薄膜过滤测定需氧菌总数方法验证小结

按照验证方案的要求进行试验，若试验组各试验菌株的回收率在0.5～2范围内，稀释剂对照组各试验菌株的的回收率也在0.5～2范围内，则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的需氧菌总数检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及计数方法进行需氧菌总数计数。

7.5. 控制菌检查方法验证—离心沉淀-薄膜过滤法

若在7.3需氧菌总数检查、霉菌和酵母菌总数检查方法验证--常规倾注平皿法的试验中，证实了人工牛黄甲硝唑胶囊有抑菌性，不能使用常规倾注平皿法进行需氧菌总数检查，则为了确保控制菌检查的可靠性，采用可去除供试品抑菌物质的离心沉淀-薄膜过滤法进行控制菌检查，按照以下方案进行方法学验证。 7.5.1试验菌株

人工牛黄甲硝唑胶囊质量标准中规定检查的控制菌为大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌，所以选择这两种菌株进行控制菌检查的方法学验证。试验菌株的传代次数不得超过5代，并采用适宜的菌种保藏技术进行保存，以保证试验菌株的生物学特性。 7.5.2 控制菌检查方法验证的菌液制备

分别接种大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物至10ml 胰酪大豆胨液体培养基中，30～

35℃培养18～24小时，取此培养液1ml 加0.9％无菌氯化钠溶液9ml ，采用10倍递增稀释法，稀释至10～10, 制成50～100cfu/ml的菌悬液备用。

菌液制备后若在室温下放置，应在2 小时内使用；若保存在2～8℃，可在24小时内使用。 验证时，对各试验菌的回收率逐一进行验证。 7.5.3大肠埃希菌检查方法验证 7.5.3.1供试液的制备

取供试品10g ，加0.9%无菌氯化钠溶液至100ml ，振摇，制成1：10的供试液贮备液。取1:10的供试液贮备液50ml ，经500转/分钟离心4分钟，取上清液得供试液。 7.5.3.2. 试验组

取供试液10ml ，加至100 ml0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次（100ml/次），然后在第3次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入7.5.2项下制备的50～100cfu 的大肠埃希菌，过滤。取膜接种至100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

取上述增菌培养物1ml 接种至100ml 麦康凯液体培养基中,42～44℃培养24～48小时。 取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。 7.5.3.3阳性对照组

照7.5.2项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将大肠埃希菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，然后以500转/分钟离心3分钟，取上层菌液作下面的试验。

取上层菌液1 ml，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm 混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次）。取膜接种至100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

取上述增菌培养物1ml 接种至100ml 麦康凯液体培养基中,42～44℃培养24～48小时。 取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～72小时。麦康凯琼脂培养基平板上应有大肠埃希菌典型菌落生长。 7.5.3.4阴性对照组

取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml，全量通过薄膜（孔径0.45μm 混合纤维素膜）后，取膜接种至100ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。阴性对照应无菌生长。 7.5.3.5离心沉淀-薄膜过滤法测定大肠埃希菌方法验证结果

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试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:

大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌种编号）

试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:

大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌种编号）

试验人/日期： 复核人/日期：

试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:

大肠埃希菌对照菌来源 批号（菌种编号）

试验人/日期： 复核人/日期： 7.5.3.6大肠埃希菌检查方法验证结果小结

按照验证方案的要求进行试验，若试验组与阳性对照组均检出典型大肠埃希菌，阴性对照组无菌生长，则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的大肠埃希菌检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及大肠埃希菌检查方法进行检查。

7.5.4沙门菌检查方法验证 7.5.4.1供试液的制备

取样品10g 加0.9%无菌氯化钠溶液至100 ml制成1:10的供试液。取全部供试液经500转/分钟离心4分钟，取全部上清液为供试液。 7.5.4.2. 试验组

取全部供试液，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜2次（100ml/次）。然后在第3次冲洗液（100ml0.9%无菌氯化钠溶液）中加入7.5.2项下制备的50～100cfu 的乙型副伤寒沙门菌，过滤。取膜接种至200ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

取上述增菌培养物0.1ml 接种至10mlRV 沙门增菌液体培养基,30～35℃培养18～24小时。 取少量RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～48小时。

沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。

用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培养基高

层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时。 7.5.4.3阳性对照组

照7.5.2项下菌液制备方法，以0.9%无菌氯化钠为稀释液，将乙型副伤寒沙门菌液稀释至含菌50～100cfu/ml，然后以500转/分钟离心3分钟，取上层菌液作下面的试验。

取上层菌液1 ml，加至100 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，混匀，全量通过薄膜（孔径0.45μm 混合纤维素膜）后，以0.9%无菌氯化钠溶液冲洗滤膜3次（100ml/次）。取膜接种至200ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。

取上述增菌培养物0.1ml 接种至10mlRV 沙门增菌液体培养基,30～35℃培养18～24小时。 取少量RV 沙门菌增菌液体培养物划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上，30～35℃培养18～48小时。

沙门菌在木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上应生长良好，菌落为淡红色或无色、透明或半透明、中心有或无黑色。

用接种针挑选出木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上的典型菌落，于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时。 7.5.4.4阴性对照组

取0.9%无菌氯化钠溶液300 ml，全量通过薄膜（孔径0.45μm 混合纤维素膜）后，取膜接种至200ml 胰酪大豆胨液体培养基中，混匀，30～35℃培养18～24小时。阴性对照应无菌生长。 7.5.4.5离心沉淀-薄膜过滤法测定乙型副伤寒沙门菌方法验证结果

试验次数1：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:

乙型副伤寒沙门菌对照菌来源 批号（菌种编号）

试验人/日期： 复核人/日期： 试验次数2：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:

乙型副伤寒沙门菌对照菌来源 批号（菌种编号）

试验人/日期： 复核人/日期：

试验次数3：人工牛黄甲硝唑胶囊批号:

乙型副伤寒沙门菌对照菌来源 批号（菌种编号）

试验人/日期： 复核人/日期： 7.5.4.6乙型副伤寒沙门菌检查方法验证结果小结

按照验证方案的要求进行试验，若试验组与阳性对照组均检出典型乙型副伤寒沙门菌，阴性对照组无菌生长，则可确认离心沉淀-薄膜过滤法适用于本品的乙型副伤寒沙门菌检查。人工牛黄甲硝唑胶囊照此验证过的供试液制备方法及乙型副伤寒沙门菌检查方法进行检查。 8. 偏差与漏项控制：

微生物限度检查方法验证过程中存在和发现的任何偏差与漏项，都应进行详细的记录，并应按公司GMP 文件《偏差处理规程》进行调查与处理。

偏差调查与处理的报告和支持文件，应作为此确认方案的附录部分。

检查人/日期： 复核人/日期：

9. 验证报告会审

验证报告会审表