骨髓间充质干细胞定向分化的经典WNT机制
文章编号 :1004-0374(2010)04-0372-05
骨髓间充质干细胞定向分化的经典WNT机制
许应星1, 吴 岩1, 肖鲁伟2*
(1 浙江中医药大学第一临床医学院,杭州 310053;2 浙江省中医骨伤研究所,杭州 310053)
摘 要:骨髓间充质干细胞的定向分化一直是干细胞研究的重点,在其分化过程中有多条信号通路参与
和调节。目前,Wnt 通路在骨髓间充质干细胞定向分化过程中的作用是国外的研究热点。研究发现经典Wnt 通路的激活与骨髓间充质干细胞的定向分化高度相关,故将其近年来的研究综述如下,从而为骨质疏松等疾病的治疗以及骨组织工程的发展提供必要的参考依据。关键词:骨髓;间充质干细胞;Wnt 信号通路;分化中图分类号:Q813;R681.2 文献标识码:A
The canonical WNT signalling pathway mechanism of bone marrow-derived mesenchymal stem cells’directional differentiation
XU Ying-xing1, WU Yan1, XIAO Lu-wei1*
(1 First Clinical Medical College of Zhejiang Traditional Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China;
2 zhejiang Province Institute of Orthopaedics and Traumatology, Hangzhou 310053, China)
Abstract: Bone marrow-derived mesenchymal stem cells’ directional differentiation has been the emphasis of stemcell research, and some signalling pathways participate and regulate the differentiation. At present, the role ofWnt signalling pathway in the bone marrow-derived mesenchymal stem cells’ directional differentiation is thefocus of foreign research. The research indicates that the activation of canonical wnt signalling pathway is relatedto bone marrow-derived mesenchymal stem cells’ directional differentiation. So we review the foreign researchin recent years in order to offer necessary reference to the treatment of osteoporosis and the development ofskeletal tissue engineering.
Key words: bone marrow; mesenchymal; stem cells; wnt signalling pathway; differentiation
骨髓间充质干细胞(bone marrow-derived mesen-chymal stem cells ,BMSCs) 是一种成体多能干细胞,可在不同条件下分化为中胚层起源的多种细胞,如成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞等。所以,骨髓间充质干细胞作为成骨细胞前体的惟一来源,其定向分化的研究可以为骨质疏松等疾病的治疗提供新的治疗途径。此外,BMSCs 具有低免疫源性,在体外易转染以及与局部组织有较好的整合能力等特点,而被当作理想的组织工程学种子细胞和基因治疗的靶细胞。所以,BMSCs 定向分化的研究一直是干细胞研究的热点,以往认为BMSCs 的定向分化与TGF-β/BMPs[1,2]、MAPK [3]通路有关,但
是近年来的研究表明,经典W n t 通路的激活在BMSCs 的定向分化过程中同样发挥着至关重要的作用。
1 Wnt通路概述
编码Wnt 蛋白的基因最先于1982年在鼠乳腺癌中发现,到1987年发现该基因的激活可以使成年的果蝇没有翅膀,故将两者统称为Wnt-1[4]。随着研
收稿日期:2009-09-29;修回日期:2009-10-30基金项目:浙江省中医药科技计划重大项目(2006z003)*通讯作者:Tel : 0571-86613684; E-mail: [email protected]
第4期许应星,等:骨髓间充质干细胞定向分化的经典WN T 机制373
究的不断深入,目前认为Wnt 包括三种分支[5]:(1)经典Wnt 信号通路,通过β-Catenin 作用激活基因转录;(2)Wnt/PCP通路,通过小G 蛋白激活c-Jun N端激酶JNK, 调控细胞骨架重排;(3)Wnt/Ca2+通路,通过胞内Ca 2+释放而影响细胞黏连和基因表达。
2 经典Wnt通路的组成及其信号传导
Wnt 通路及其各组成部分的功能和结构在各种生物的进化过程中高度保守,经典的Wnt 信号通路由W nt 糖蛋白(主要是W nt1、W nt3a 、W nt8a 、Wnt10b 等) 、β-Catenin 、卷轴受体(frizzled receptor),以及低密度脂蛋白受体相关蛋白L R P 5/6、D s h (Dishevelled)、糖原合成激酶(GSK-3β) 、淋巴增强因子(LEF)/T细胞因子(TCF)转录因子等组成[5]。Wnt 经典信号通路的激活由分泌型Wnt 糖蛋白与卷轴受体的结合而起始。Frizzled 为细胞膜表面的一类具有七次跨膜结构的受体蛋白,与细胞表面的另一类LRP5/6受体共同组成配体Wnt 的特异结合靶点。配体Wnt 与Frizzled 的特异结合能够激活细胞内含有PDZ 结构域的蛋白Dsh ,Dsh 释放信号抑制GSK-3β对β-Catenin 的降解活性。这一过程中,Dsh 首先激活鸟苷酸结合蛋白(GBP),由GBP 将GSK-3β从降解复合体上解离下来,最终导致β-Catenin 在胞浆中稳定积累并进入细胞核内激活LEF/TCF转录因子,启动靶基因转录[5]。
通路中的各个环节都有各自相应的功能,精细地调节着Wnt 信号通路的传导,倘若其中的一个环节发生改变,将会影响到Wnt 通路,乃至成骨细胞的活性,如LRP5发生突变将会导致骨质疏松-假神经胶质瘤综合征(OPPG)的发生[6],而且更多的研究表明,LRP5与骨密度具有高度的相关性[7]。所以,经典的Wnt 通路能够被Dkkl 和Sost 蛋白通过竞争性地与LRP5/6相结合而阻断,从而导致骨质疏松等症的发生[7]。然而,Dkkl 和Sost 蛋白仅在成体鼠的成骨细胞和骨细胞(osteocyte)中表达,因此,系统处理Dkkl 和Sost 将可能只影响骨组织的Wnt 信号通路,增强骨形成,而不影响其他器官。靶向Dkkl 和Sost 的重组单克隆抗体将会对骨质疏松症的治疗取得良好的效果。此外,卷轴受体的突变也会影响Wnt 信号的传导,如分泌型Frizzled 相关蛋白 (SFRPs)就可以通过阻断Wnt 蛋白与Frizzled 、LRP5/6的结合来抑制Wnt 信号通路[8]。
3 经典Wnt信号对骨髓间充质干细胞的作用
3.1 经典Wnt信号促进BMSCs向成骨细胞分化
以往的研究表明,Wnt 通路的激活能够促进成骨细胞的增殖和分化,对于促进骨形成具有至关重要的作用。但是近年来,国外的研究更多地集中于BMSCs 定向分化的方面,并且诸多的研究表明,各成分的改变所导致的Wnt 通路的激活能够明显地促进BMSCs 向成骨细胞分化。Qiu 等[9]利用LRP5基因突变大鼠探讨了Wnt 通路对人BMSCs 定向分化的影响。一方面,LRP5能够通过经典的Wnt 通路来促进人BMSCs 向成骨细胞分化,即上调了CbfaI /Runx2和ALP 的表达;另一方面,LRP5还能够抑制脂肪细胞的生成,即下调了C /EBP α和PPAR -γ的表达。而Si 等[10]的研究则表明在CCN1/Cyr61基因敲除小鼠中,Wnt3A 诱导BMSCs 向成骨细胞分化的作用减弱,表明Wnt3A 可以通过Wnt 通路来激活CCN1/Cyr61基因,从而促进BMSCs 向成骨细胞的分化。Bennett 等[11]利用Wnt10b 骨髓转基因鼠的模型研究表明,W nt10b 骨髓转基因鼠中,成骨转录因子Runx2、Dlx5、osterix 的表达显著增加,而脂肪形成转录因子C /EBP α和PPAR -γ的表达显著下降,说明wnt10b 能够促进BMSCs 向成骨细胞分化同时抑制脂肪的生成。同时,Bennett 等[12]研究还表明wnt10b 可通过促进BMSCs 向成骨细胞的分化来增加前成骨细胞的数目,并且促进前成骨细胞的分化成熟来促进骨形成,增加全身的骨量。此外,在BMSCs 与成骨细胞的共同培养体系中,成熟的成骨细胞可以通过旁分泌的方式分泌Wnt10b 来促进BMSCs 进一步向成骨细胞的分化[13]。除了Wnt 相关蛋白之外,W n t 通路的其他因子同样可以影响BMSCs 的定向分化。研究表明,Runx2是经典Wnt 通路中的一个靶基因,β-c atenin 的稳定表达和TCF1的激活能够启动早期成骨细胞转录因子Runx2/Cbfa1/Aml3表达,从而来决定BMSCs 向成骨细胞的分化[14]。此外,以往认为糖皮质激素可以通过抑制骨形成来导致骨质疏松等疾病的发生。然而,近年来国外的研究表明,糖皮质激素可以通过对Wnt 通路的调节来影响BMSCs 向成骨细胞的分化,如糖皮质激素还可以通过增加frizzled 相关蛋白(SFRP1)的表达来抑制Wnt 通路,从而抑制BMSCs 向成骨细胞的分化,抑制骨形成[15]。给予过量的地塞米松可以导致BMSCs 向成骨细胞的分化减少,但是DKK1
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基因敲除鼠则减弱了地塞米松这种作用,说明地塞米松可以通过DKK1来抑制Wnt 通路的传导,从而抑制BMSCs 向成骨细胞分化[16]。
3.2 经典Wnt信号抑制BMSCs向脂肪细胞分化
生理状态下,BMSCs 向成骨细胞和脂肪细胞分化,两者之间保持着动态的平衡,由于各种原因两者之间的这种平衡被打破时,就会导致骨质疏松症等疾病的发生[17],如老年骨质疏松症患者和绝经后骨质疏松症患者骨髓中的脂肪细胞明显多于正常人,BMSCs 倾向于脂肪细胞分化,从而导致向成骨细胞的分化减少,所以骨髓中成骨细胞和脂肪细胞的数目对骨骼的形成起着至关重要的作用。然而Wnt 通路的激活不仅可以促进BMSCs 向成骨细胞分化,同时还可以抑制脂肪细胞的生成。2007年,Kang 等[18]证实,在具有双向潜能的ST2细胞系中,短暂地激活wnt/β-catenin 信号通路能够快速抑制C/EBP α和PPAR-γ的表达,从而激活成骨标志基因Runx2、Dlx5和osterix 的转录,这表明wnt/β-catenin 信号通路通过抑制C /EBP α和PPAR-γ来决定BMSCs 分化的命运。另外,wntl0b 的转基因肥胖型鼠正常饲喂第8周时,内脏与皮下脂肪组织与野生型相比减少了70%,同时并未发生代谢紊乱,提示wntl0b 不仅能改善饮食引起的肥胖症,同样能改善遗传性肥胖症。wntl0b 不仅能抑制白色脂肪组织的发育,而且能阻止棕色脂肪的生成[19]。辅助受体LRP5和LRP6在整个脂肪细胞分化过程中始终有表达,但伴随着Wnt 抑制因子DKK1短暂上调,LRP5和LRP6会短暂下调,这也提示,在脂肪细胞分化过程中,LRP5和LRP6协助DKK1抑制Wnt 信号通路,促进脂肪细胞分化[20]。2002年,Roos 等[21]根据mRNA 微阵列的分析结果显示,Wnt 信号可改变细胞周期中各基因的表达,对这些异常表达基因的分析也有助于理解Wnt 抑制脂肪形成的机制。此外,一些影响骨形成和骨吸收偶联的因素同样可以通过Wnt 通路来调节BMSCs 的分化,如维生素D 受体可以通过抑制Dkkl 和SFRPs 来激活Wnt 通路,从而抑制脂肪细胞的生成[22]。糖皮质激素类药物也可以通过Wnt 通路来影响BMSCs 向脂肪细胞的分化。给予过量的地塞米松可以导致BMSCs 向成骨细胞的分化减少,而脂肪细胞的生成增多。但是DKK1基因敲除鼠则减弱了地塞米松这种作用,说明地塞米松可以通过DKK1来抑制Wnt 通路的传导,从而决定BMSCs 分化的命运——抑制成骨,并促进脂肪细胞的生成[16]。不仅如此,细胞因子如白细胞介素-6(IL-6)
和肿瘤坏死因子-α(TNF-α) 可能对Wnt 也起到一定的调节作用,通过Wnt 通路可以影响脂肪细胞的分化。Gustafson 和Smith [23]的研究表明,IL-6促进wntl0b 的表达,而IL-6增加了Dvl 的磷酸化,两者均激活了Wnt 信号,激活的Wnt 信号可削弱前体脂肪细胞正常分化和脂质积累。生长停滞的前体脂肪细胞在成脂诱导液下分化,TNF-α维持Wnt 激活,而IL-6持续激活Fz/LRP/Dvl复合体,这样,2个细胞因子均阻止了G 联蛋白的正常降解。在下游水平,通过抑制C/EBPα和PPAR-γ使脂肪细胞分化被削弱或被阻止。
3.3 经典Wnt信号促进BMSCs向骨骼肌细胞分化
目前为止,国内外对于BMSCs 向骨骼肌细胞分化的研究不多,仅有的一些研究表明,BMSCs 向骨骼肌细胞的分化与经典Wnt 通路的激活有关。Shang 等[24]观察wnt3a 基因转染大鼠BMSCs 后,发现与肌细胞生成相关的基因,如Pax 7、M y o D 、Myf5、Myf4以及肌细胞生成素等被显著地激活,同时抑制了脂肪形成转录因子C/EBPα和PPAR-γ的表达。表明在一定条件下,Wnt 通路的激活可以促进BMSCs 向骨骼肌分化并抑制脂肪细胞的生成。此外,Bedada 等[25]用Wnt1、Wnt3、Wnt7a 、Wnt7b 、Wnt4和Wnt11 分别处理BMSCs ,观察不同Wnt 蛋白促进BMSCs 向骨骼肌细胞的差异,研究表明这些不同的Wnt 蛋白均可以上调至少一种生肌因子的表达mRNA 表达,而Wnt11则可以上调骨骼肌特异性生成因子Myf5、MyoD 、肌细胞生成素和生肌调节因子4(MRF4) 的mRNA 表达。
3.4 经典Wnt信号与BMSCs向心肌细胞的分化
诸多研究表明,Wnt 信号通路在胚胎干细胞向心肌细胞分化的过程中占据着重要的作用[26],虽然BMSCs 同样也是形成心肌细胞前体的主要来源之一[27],但是无论国内还是国外,关于Wnt 信号通路在BMSCs 向心肌细胞分化过程中作用的报道并不多,并且主要集中在非经典Wnt 信号通路方面,研究表明Wnt-11激活的非经典Wnt 信号通路可以促进大鼠BMSCs 向心肌细胞分化[28,29]。但是,目前Zelarayan 等[30]证明Wnt/β-catenin 的激活可以促进间充质细胞向心肌细胞分化,然而心肌细胞后期的分化却需要下调β-catenin 。所以,虽然诸多研究并未明确指出经典Wnt 信号通路在BMSCs 向心肌细胞分化过程中的作用,但是基于Wnt 信号通路在心肌细胞形成和分化过程中的重要性,经典Wnt 信号通路的这一重要作用将会得到进一步的阐明。
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图1 不同条件下Wnt通路的状态对BMSCs定向分化的影响
4 结语和展望
综上所述,Wnt 信号通路在BMSCs 定向分化中占据着重要作用,不同条件下Wnt 信号通路的激活或者抑制决定着BMSCs 分化的方向(图1) 。所以,作为理想的种子细胞,掌握BMSCs 定向分化的条件可以更好地为组织工程、 细胞治疗和基因治疗提供所需细胞,在骨质疏松症、骨骼肌疾病和心血管疾病等诸多临床疾病的治疗中发挥重要作用。然而,Wnt 通路影响BMSCs 定向分化的作用仍然还有许多问题尚未解决,如在复杂的人体骨骼内环境中,Wnt 通路的激活影响BMSCs 向各种细胞分化的具体条件需要得到进一步的阐明,并且BMSCs 的分化过程十分复杂,诸多信号通路均可以影响BMSCs 的定向分化,而Wnt 通路与其他的信号通路之间如何交叉串扰,如何共同调节BMSCs 的分化,Wnt 通路在其中又占据着何种地位,希望在不久的将来,这些问题将会逐一得到解决。
[参 考 文 献]
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