三种致病菌在鲜榨苹果汁中的生存_死亡概率预测模型

三种致病菌在鲜榨苹果汁中的生存／

死亡概率预测模型

李　军１，２，汪政富３，葛毅强３，胡小松３

（１．中国检验检疫科学研究院，北京　　　　　１０００２５；２．河北科技师范学院食品工程系，秦皇岛　　　　　０６６６００；

３．中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京　　　　　　１０００８３）

摘　　　要：采用三因素五水平中心组合试验设计（ＣＣＤ），应用二值变量描述了大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌等致病菌在不同温度、ｐＨ和水分活度下的生存状况，通过Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归过程建立了生存概率与生长抑制因子之间关系的数学预测模型，确定了其在鲜榨苹果汁中生存的限制条件，同时分析了温度、ｐＨ和水分活度在生长临界条件下的协同作用。经过实验验证，大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的生存概率模型的预测结果与实际测定结果基本一致，在鲜榨苹果的水分活度下（Ａｗ＝０．９８左右），生存概率ｐ＝０．１时的等值线可以作为细菌生存的临界线，从而确定鲜榨苹果汁中致病菌的生存临界条件。

关键词：鲜榨苹果汁；致病菌；生存／死亡概率预测模型

Ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ　Ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　Ｇｒｏｗｔｈ／ｎｏ－ｇｒｏｗｔｈ　Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｏｆ　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ

ｅｎｔｅｒｉｃａ　ａｎｄ　Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　Ｈｅｎｒｉｃｉ　ｉｎ　Ｆｒｅｓｈ　Ａｐｐｌｅ　Ｊｕｉｃｅｓ

ＬＩ　Ｊｕｎ１，２，ＷＡＮＧ　Ｚｈｅｎｇ－ｆｕ１，ＧＥ　Ｙｉ－ｑｉａｎｇ３，ＨＵ　Ｘｉａｏ－ｓｏｎｇ３

（１．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ　　　　　　１０００２５，　Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，

Ｈｅｂｅｉ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，　Ｑｉｎｈｕａｎｇｄａｏ　　　　　　　０６６０００，　Ｃｈｉｎａ；３．　Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｆｏｏｄ

Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，　Ｂｅｉｊｉｎｇ　　　　　　　　１０００８３，　Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ　：Ｂｙ　ｍｅａｎｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｆｉｖｅ－ｌｅｖｅｌ　ｖａｒｉａｂｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ　Ｄｅｓｉｇｎ　（ＣＣＤ），　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ａｎｄ　ｎｏ　ｇｒｏｗｔｈ　ｓｉｔｕａｔｉｏｎｓｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒａｉｎｓ，　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ，　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｃａ　ａｎｄ　Ｓａｒｃｉｎａ　ａｕｒｅａ　Ｈｅｎｒｉｃｉ　ｕｎｄｅｒ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，　ｐＨ　ａｎｄｗａｔｅｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　（Ａｗ）　ｗｅｒｅ　ｓｔｕｄｉｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｗｏ－ｖａｌｕｅｄ　ｖａｒｉａｂｌｅｓ．　Ｔｈｒｅｅ　ｍａｔｈｅｍａｔｉｃａｌ　ｍｏｄｅｌｓ　ｔｏ　ｐｒｅｄｉｃｔ　ｔｈｅ　ｒｅｌａｔｉｏｎｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖｉｎｇｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｗｅｒｅ　ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｌｏｇｉｓｔｉｃ　Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，　ａｎｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｍｏｄｅｌｓ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｔｒａｉｎｔｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｓｕｒｖｉｖｅｄ　ｉｎ　ｆｒｕｉｔ　ｊｕｉｃｅｓ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ，　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｐＨ，　Ａｗ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｕｎｄｅｒ　ｃｒｉｔｉｃａｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｗｅｒｅ　ａｎａｌｙｚｅｄ．　Ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｏｕｔｃｏｍｅｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ　ｍｏｄｅｌｓ　ａｇｒｅｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ａｂｏｖｅｍｅｎｔｉｏｎｅｄ　ｔｈｒｅｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ．　Ｔｈｅ　ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ　ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ　ｉｓｏｌｉｎｅ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　０．９８　Ａｗ　ｗｉｔｈ　ｐ＝０．１　Ｃｏｕｌｄ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａ　ｃｒｉｔｉｃａｌｌｉｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ　ｃｒｉｔｉｃａｌ　ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｐａｔｈａｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｒｅｓｈ　ａｐｐｌｅ　ｊｕｉｃｅｓ．Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：ｆｒｅｓｈ　ａｐｐｌｅ　ｊｕｉｃｅ；ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｂａｃｔｅｒｉａ；ｇｒｏｗｔｈ／ｎｏ－ｇｒｏｗｔｈ　ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　ｍｏｄｅｌ

中图分类号：ＴＳ２０１．３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码：Ａ　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号：１００２－６６３０（２００５）１２－０１１８－０６收稿日期：２００４－１０－１４

基金项目：国家“十五”重大科技专项（２００１ＢＡ５０１Ａ２１）

作者简介：李军（１９７１－），男，博士，研究方向为农产品贮藏与加工及食品安全。

α－ｔｅｒｐｉｎｅｏｌ　ｗｉｔｈ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｏｒｇａｎｉｃ　ａｃｉｄｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅＰｌａｃｋｅｔｔ－Ｂｕｒｍａｎ　ｄｅｓｉｇｎ［Ｊ］．　Ｐｒｏｃｅｓｓ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，　２００１，　３６：１１２５－１１２８．

［７］

Ｄｕｂｏｉｓ　Ｍ，　Ｇｉｌｌｅｓ　Ｋ　Ａ，　Ｈａｍｉｌｔｏｎ　Ｊ　Ｋ，　ｅｔ　ａｌ．　Ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｕｇａｒｓ　ａｎｄ　ｒｅｌａｔｅｄ　ｓｕｂｓｔａｎｃｅｓ［Ｊ］．　Ａｎａｌ　Ｃｈｅｍ，　１９５６，　２８：　３５０－３５６．

目前在欧洲和美国鲜榨苹果汁的销量已占市场总额的４０％以上［１］，鲜榨苹果汁已经成为苹果加工未来发展一个重要方向。

为了保持鲜榨苹果汁的新鲜风味和口感，一般不进行加热杀菌而采用非热杀菌（Ｎｏｎ－ｔｈｅｒｍａｌ　Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）技术保持果汁的生物稳定性［２］。与加热杀菌相比，非热杀菌效果较差，虽然果汁出厂前一般可以达到卫生质量要求，但是鲜榨苹果汁在冷链运输过程中，如果环境条件控制不当，很可能造成致病菌的大量增生。

通过调节环境温度、酸度和水分含量对食品质量进行控制是千百年来人类沿用的贮藏加工技术，随着经验和数据的不断积累已经形成了较为完善的栅栏理论（ＨｕｒｄｌｅＣｏｎｃｅｐｔ）体系，并在肉制品和海产品的加工贮藏中得到了广泛应用，成为现代食品加工技术的重要组成部分［３］

。将栅栏理论应用于鲜榨苹果汁的加工和贮运过程，在相对温和的条件下通过控制环境条件变化抑制微生物的生长和繁殖将会更好的保持产品的新鲜风味和营养。

预测微生物学（Ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）是现代食品微生物学的一个重要分支，它是根据微生物在不同环境条件生长变化规律，建立微生物生长状况和环境条件之间关系的数学模型，客观评价加工和贮运过程对食品卫生安全质量影响的一门新兴学科［４］。生存概率预测是预测微生物学的主要内容，概率预测模型是用数学方法对食品中致病菌在不同环境条件下的生存状况进行描述，掌握其在生存／死亡临界条件，为生产中合理控制环境条件，保证产品卫生安全质量提供依据。随着人民生活水平的不断提高，消费者对于食品卫生安全质量的要求也越来越高。致病菌的概率预测模型随着数据的丰富，而更加完善，准确性不断提高，为微生物检验提供了一种低成本、操作简便、结果可靠的快速判定方法，克服了传统的食品卫生检验方法成本高、耗时、繁琐的缺点，已经逐渐成为食品微生物检验和食品安全预警系统的重要技术手段。

自从Ｒａｔｋｏｗｓｋｙ和Ｒｏｓｓ将Ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归模型应用于食品微生物以来，近几年来对不同环境条件下微生物的概率预测模型研究发展非常迅速，其巨大潜力吸引了研究者的巨大的兴趣和资金，包括美国、英国、澳大利亚以及欧洲［５～７］。Ｇｉｂｓｏｎ等在对非恒温过程中细菌细胞耐热性进行了研究，通过活菌计数法，得到大肠杆菌热致死数与加热温度、ｐＨ　值、水分活度等环境参数之间关系的数据，并以此为基础提出了增殖延迟时间解析法，已成为重要基础实验方法［１４］。本研究的目的：通过建立鲜榨苹果汁中主要致病菌的存活／死亡概率预测模型，用数学方法描述环境因素如：温度、ｐＨ值和水分活度Ａｗ　对其生存概率的影响，确定其在鲜榨苹果汁中生存的限制条件，从而通过调整鲜榨苹果汁的成分和控制其运输

和贮存温度达到限制致病菌存活的目的，同时为控制鲜榨苹果汁的生产、运输和贮存条件，限制致病菌的生长，提供了理论依据。１１．１

材料与方法

菌株

大肠杆菌（ＣＧＭＣＣ　ＡＳ１．９０）、沙门氏菌（ＣＧＭＣＣ　ＡＳ１．１５５２）和金黄色葡萄球菌（ＣＧＭＣＣ　ＡＳ１．１２８），均购自中国科学院微生物研究所。上述菌种均划线培养于ＬＢ试管斜面，４℃冰箱贮存，每月传代一次以保持活力。１．２主要仪器和试剂

ＢＤ５－ＭＳ２１００水分活度快速测试仪　　　　北京北斗星工业化学研究所生产；ｐＨＳ－３Ｃ酸度计　　　　萧山市鑫龙医疗仪器有限公司生产；７２３分光光度仪　　　　上海光谱仪器厂；甘油，分析纯　　　　天津市化学试剂二厂；苹果酸，分析纯，ＤＬ苹果酸　　　　北京化工厂。１．３方法

鲜榨苹果汁的制备

选取新鲜成熟无病斑、无划伤的国光苹果，清洗干净后切瓣去除果梗、果蒂和果核，放入匀浆机中打成匀浆，经小型榨汁机压榨得到的苹果汁，高温短时灭酶处理后，通过０．２μｍ的Ｐａｌｌ过滤器过滤得到鲜榨苹果清汁，透光率为９８．５％，灌装于无菌塑料桶中，４℃冰箱贮存备用。

实验过程中ｐＨ值以２５％苹果酸溶液调整，用　ｐＨ计测定；水分活度Ａｗ用８０％甘油溶液调整，用水分活度计测定。１．３．２

标准吸收曲线的绘制

取用肉汤培养基３７℃富集培养２４ｈ的菌液１０ｍｌ，１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，用无菌蒸馏水冲洗２次，依次用鲜榨苹果汁稀释到１０－１，１０－２，１０－３……１０－１０稀释度，以鲜榨苹果汁作空白，分别测其吸光度；取１０－６以后的稀释度铺平板，３７℃培养２４ｈ后菌落计数，以菌液浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标绘出该种菌的标准吸收曲线。１．３．３

细菌生长条件理论最低值的确定

用肉汤培养基培养三种致病菌，通过调整温度、１．３．１

水分活度和ｐＨ测定最大生长速率，计算生长条件理论最低值。

在对数生长期内，微生物的群体生长类似于化学反应的一级自身催化反应，即某一时刻细胞数量（或菌体质量）的增加速率和该时刻的细胞数目（或质量）之比为常数。如果在对数生长期ｔ０时测得细胞数目为Ｎ０，ｔ时测得Ｎｔ，根据下式可计算出培养物的比生长速率常数μ：

　（ｌｇＮｔ－ｌｇＮ０）

μ＝—————————×２．３０３　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（１）

ｔ－ｔ０

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　

最低生长温度Ｔｍｉｎ，由水分活度为ＡＷ＝０．９９，ｐＨ６．５时不同温度条件下三种致病菌在肉汤培养基中的比生长速率，采用ＳＰＳＳ　Ｖ１１．０统计软件，应用Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔ过程对Ｒａｔｋｏｗｓｋｙ模型参数进行迭代计算得出。

μｍａｘ＝ｂ（Ｔ－Ｔｍｉｎ｛）１－ｅｘｐ［ｃ（Ｔ－Ｔｍａｘ）］｝　　　　　　　　　　　　　　　（２）

式中：

μｍａｘ—细菌最大生长速度（无量纲数）；

Ｔｍｉｎ，Ｔｍａｘ—细菌生长的理论极限温度值（℃）；ｂ，　ｃ－分别为模型参数（无量纲数）。

同样对于最低水分活度Ａｗｍｉｎ和ｐＨｍｉｎ，首先测定温度为３７℃，ｐＨ６．５，水分活度Ａｗ分别为０．９３、０．９４、０．９５、　０．９６、　０．９７、　０．９８　和０．９９时以及温度为３７℃，水分活度Ａｗ＝０．９９，　ｐＨ分别为７、　６、　５、４和３时，三种致病菌的最大生长速率，然后根据由Ｒａｔｋｏｗｓｋｙ修正的Ｇｏｍｐｅｒｔｚ公式：

μｍａｘ＝ａ・（Ａｗ－Ａｗｍｉｎ）・（ｐＨ－ｐＨｍｉｎ）・（Ｔ－Ｔｍｉｎ）２　　　　　　　　　　　　　（３）代入Ｔｍｉｎ，应用ＳＰＳＳ　Ｖ１１．０统计软件的Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔ过程对Ｒａｔｋｏｗｓｋｙ模型参数进行迭代计算出限制微生物生长的水分活度、ｐＨ的理论最低值Ａｗｍｉｎ和ｐＨｍｉｎ。１．３．４

生存概率的测定

取１ｍｌ经过鲜榨苹果汁稀释的肉汤增菌液，注入到

ＯＤ值ＯＤ值

１２３４５６７

总菌数对数值ｌｏｇＮ

（ａ）

ＯＤ值

总菌数对数值ｌｏｇＮ

（ｂ）

盛有９ｍｌ　ｐＨ和水分活度已经过调整的鲜榨苹果汁的大试管中，使菌液浓度为５．０２×１０３ＣＦＵ／ｍｌ，在不同温度下培养４８ｈ后，测定吸光度值，如果已接种的鲜榨苹果汁在培养前后吸光度值差值＜０．００２（±０．００２为分光光度计的相对误差范围），则计为该致病菌能够生存（用二值变量１表示），无显著差别则计为不能生存（用二值变量０表示）。１．４

实验设计与统计分析

采用三因素五水平中心组合试验设计（ＣＣＤ）方案，每一个实验组合平行安排两次实验。实验结果经Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ　ｖ　６．０统计软件，应用ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归过程进行数据处理，模拟方程如下：

ｐ

ｌｎ（———）

１－ｐ

＝ｂ０＋ｂ１ｌｎ（Ｔ－Ｔｍｉｎ）＋ｂ２ｌｎ（ｐＨ－ｐＨｍｉｎ）＋ｂ３ｌｎ（Ａｗ－Ａｗｍｉｎ）

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　（４）数学模型的拟和度经过ｘ２检验。２２．１

结果与分析标准曲线的绘制

总菌数对数值ｌｏｇＮ

（ｃ）

图１　　　大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌在鲜榨苹果汁中的菌液

浓度与吸光度值的标准曲线

Fig.1 The regression curve between the bacteria concentrationand OD of E.coli, Salmonella enteritidis, Sarcina aurea Henrici表１　　　水分活度Aw=0.99, pH6.5时，不同温度下大肠杆菌、沙门氏

菌和金黄色葡萄球菌生长速率(h-1)

Table 1 The growth rate of the E.coli, Salmonella enteritidis,Sarcina aurea Henrici when the condition is Aw=0.99, pH6.5温度（℃）

８１５２０２５３０３５４０４５５０５５

生长速率（ｈ－１）

大肠杆菌０．０１０．２０．３３０．４６０．５７０．６７０．７２０．６９０．５０

沙门氏菌０．０６０．１７０．２５０．３３０．３９０．４４０．４５０．４２０．２９０

金黄色葡萄球菌

００．２０．３６０．５０．６１０．６９０．７０．６３０．４１０

图１中ａ、ｂ、ｃ图分别是大肠杆菌、沙门氏菌、

金黄色葡萄球菌在鲜榨苹果汁中的菌液浓度与吸光度值的标准曲线，相关系数都在０．９７以上。２．２

细菌生长限制条件理论最低值的确定

表１是水分活度Ａｗ＝０．９９，ｐＨ６．５时，根据不同温

度下处于对数生长期的大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的吸光度值查标准曲线求得细菌浓度后由公式（１）计算得出的细菌生长速率（ｈ－１）。由表２数据，采用ＳＰＳＳＶ１１．０统计软件，应用Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇ－Ｍａｒｑｕａｒｄｔ过程对Ｒａｔｋｏｗｓｋｙ模型参数进行迭代计算得出公式（２）的参数估计值，同时求出三种细菌的最低理论生长温度Ｔｍｉｎ。

表２　　　　三种致病菌生长速率模型的参数估计值

Table 2 Estimated values of the coefficients of the predictivemodels for specific growth rate of the three pathogenic bacteria数学模型大肠杆菌

相关系数Ｒ２

０．９９９９６

参数ｂｃＴｍｉｎＴｍａｘ

沙门氏菌

０．９９９７２

ｂｃＴｍｉｎＴｍａｘ

金黄色葡萄球菌

０．９９９３６

ｂｃＴｍｉｎＴｍａｘ

参数估计值０．０２７０．１１４７．６０５５．０００．０１６９０．０９４４４．５２５５．０００．０３３９０．０７０３８．３０５４．９７

９５％置信区间０．０２６８７２９２１　　　０．０２７５１４１５１０．１１１２１２８５０　　　０．１１５９１３２０７７．４５２１０６６６７　　　７．７５５３７３６３６５４．９６７３７０４３８　５５．０３４３２９６１４０．０１６２８７７６１　　　０．０１７５４０６６９０．０８８９８０４９４　　　０．０９９９０３１２６４．０２７６３３０５３　　　５．０１９９２４９６５５４．９０５４６８０５４　５５．０９９４３８２９６０．０３１７８９８９７　　　０．０３６０７７７５７０．０６３２６７４５２　　　０．０７７３３８０８７７．７８２１２２８１９　　　８．８１６５８７６６０５４．７９８４３７２０８　５５．１４７８６３３６３

表３　　　温度为37℃时，不同水分活度下和pH条件下大肠杆菌、沙门

氏菌和金黄色葡萄球菌生长速率(h-1)

Table 3 The growth rate of the E.coli, Salmonella enteritidis,Sarcina aurea Henrici at different pH and Aw conditions when the

temperture is 37℃

水分活度０．９４０．９４０．９４０．９４０．９４０．９４０．９５０．９５０．９５０．９５０．９５０．９５０．９６０．９６０．９６０．９６０．９６０．９６０．９７０．９７０．９７０．９７０．９７０．９７０．９８０．９８０．９８０．９８０．９８０．９８０．９９０．９９０．９９０．９９０．９９０．９９

ｐＨ３．５３．８４．２４．６５５．５３．５３．８４．２４．６５５．５３．５３．８４．２４．６５５．５３．５３．８４．２４．６５５．５３．５３．８４．２４．６５５．５３．５３．８４．２４．６５５．５

生长速率（ｈ－１）

大肠杆菌

０００．００６１０．０３６５０．０６６９０．１０５０００．０２１３０．１２７８０．２３４３０．３６７４０００．０３６５０．２１９１０．４０１６０．６２９８０００．０５１７０．３１０３０．５６９０．８９２２０００．０６６９０．４０１６０．７３６３１．１５４６０００．０８２１０．４９２９０．９０３６１．４１７１

沙门氏菌

０００．０１８９０．０４５９０．０７２９０．１０６７０００．１１３４０．２７５５０．４３７５０．６４０１０００．２０８０．５０５０．８０２１１．１７３４０００．３０２５０．７３４６１．１６６７１．７０６８０００．３９７０．９６４１１．５３１３２．２４０２０００．４９１５１．１９３７１．８９５９２．７７３６

金黄色葡萄球菌

００００．０３４５０．０６９１０．１１２２００００．１２０９０．２４１７０．３９２８００００．２０７２０．４１４３０．６７３３００００．２９３５０．５８７０．９５３９００００．３７９８０．７５９６１．２３４４００００．４６６１０．９３２３１．５１５

表３　是温度为３７℃时，不同水分活度和ｐＨ条件下大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌生长速率（ｈ－１），由表中生长速率数值和最低生长温度的理论值Ｔｍｉｎ，根据公式（３）可以计算出三种致病菌的在最适生长温度下的最低水分活度和最低ｐＨ，结果见表４。

表４　　大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌生长温度、ｐＨ和水分

活度的最低值

Table 4 Minimum values of pH (pHmin), temperature (Tmin)andwater activity (Awmin) allowing the growth of E.coli, Salmonella

enteritidis, Sarcina aurea Henrici

致病菌大肠杆菌沙门氏菌金黄色葡萄球菌

Ｔｍｉｎ７．６０４．５２８．３０

Ａｗｍｉｎ０．９３６０．９３８０．９３６

ｐＨｍｉｎ４．１２３．９２４．２０

微生物生长繁殖和化学反应利用的水分主要是自由水［１２］。这就为提高水分含量较高鲜榨苹果汁的保质期提供了理论依据。每种微生物都有最低生长水分活度：一般革兰氏阴性杆菌、部分真菌的孢子及某些酵母菌的最低水分活度＞０．９５；大多数球菌、乳杆菌、杆菌科的营养细胞及一些霉菌的最低生长水分活度在０．９５～０．９１之间；大多数酵母在０．９１～０．８７在之间；大多数霉菌、金黄色葡萄球菌在０．８７～０．８０之间；大多数耐盐酵母在０．８０～０．７５之间；耐干燥霉菌在０．７５～０．６５之间；耐高渗酵母在０．６５～０．６０之间；在＜０．６０时，任何微生物都不生长［１３］。

实验计算出的最低水分活度较文献报道的不完全一致。大肠杆菌和沙门氏菌最低水分活度偏低，而金黄色葡萄球菌的最低水分活度偏高。这可能与以甘油作为水分活度调节剂有关，甘油比盐类更容易渗入细胞内部，可以较快降低细胞内部的水分活度，并对细胞器和大分子物质有一定的保护作用。２．３

温度、ｐＨ和水分活度对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌生存概率的影响

根据细菌生长限制条件最低值和鲜榨苹果汁的贮存温度和水分活度范围，按照三因素五水平ＣＣＤ方案进行实验设计。表１　是温度、ｐＨ和水分活度对大肠杆菌、

表５　　　温度、ｐＨ和水分活度对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球

菌生存概率的影响

Table 5 Effect of temperature, pH and Aw on growth of E.coli,

Salmonella enteritidis, Sarcina aurea Henrici温度Ｔ（℃）１４１４１４１４２２２２２２２２１０２６１８１８１８１８１８１８１８１８１８１８１８１８１８

水分活度Ａ

ｗ

水平。通过ｌｏｇｉｓｔｉｃ生存概率数学模型可以分析温度、水分活度和ｐＨ对细菌生长交互影响的程度进行评价，

并对其生长的极限条件进行预测。２．４

生存概率模型对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的生存极限条件的预测

表７　　　生长概率p=0.1时应用Logistic回归数学模型对三种致病菌生存

极限ｐＨ值的预测

Table 7 The predicted pH of the no-growth interface when the

growth probability is p=0.1

温度Ｔ（℃）１４１４２２２２１０２６１８１８１８

水分活度Ａ

ｗ

生存概率ｐ

大肠杆菌１１１１０１１１０１０１０１１１１１１１１１１

沙门氏菌０１１１１１１１０１１１１１１１１１１１１１１

金黄色葡萄球菌

０１１１０１１１０１０１０１１１１１１１１１１

实验号１２３４５６７８９１０１１１２１３１４１５１６１７１８１９２０２１２２２３

ｐＨ４．４４．４４．８４．８４．４４．４４．８４．８４．６４．６４．２５．０４．６４．６４．６４．６４．６４．６４．６４．６４．６４．６４．６

０．９５０．９７０．９５０．９７０．９５０．９７０．９５０．９７０．９６０．９６０．９６０．９６０．９４０．９８０．９６０．９６０．９６０．９６０．９６０．９６０．９６０．９６０．９６

生存极限ｐＨ值

大肠杆菌４．８５１７３１４．４２１３０１４．５３０７７２４．２８９１４１４．９７８１３３４．３２１２４４４．４２２０９４５．９３２５６６４．２８４７７９

沙门氏菌４．４３８６５１４．２９０７４４４．１４０４０１４．０７７５４８４．８２７１６４．０５４２５９４．１７７６０２４．５０５３２５４．１２６４５６

金黄色葡萄球菌

４．６１８６４４．３９７５５４．４７１１６８４．３２７９６４．６８２９６３４．３５１３６１４．４０３８７６５．１２８９６２４．３２２０５６

０．９５０．９７０．９５０．９７０．９６０．９６０．９６０．９４０．９８

表７表示大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌在鲜榨苹果汁中生存概率ｐ＝０．１时，不同生长温度和水份活度条件下，应用ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归数学模型计算得出的生存极限ｐＨ值。同理也可对其它条件下，细菌的生长的极限温度、水分活度进行预测。２．５

生存临界条件下大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的生存抑制因子间的交互作用

图３　中ａ、ｂ、ｃ图分别表示在鲜榨苹果汁中，生存临界条件下（ｐ＝０．１时）大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌不同温度、ｐＨ和水分活度间的交互作用，由图中曲线可以看出，ｐＨ和水分活度对细菌生存极限温度的影响存在交互作用。细菌的生存温度随水分活度增大和ｐＨ的提高而降低，在较高的水分活度和ｐＨ条件下，抑制致病菌的生长，鲜榨苹果汁的贮存温度必须控制在较低范围内，这对生产和贮存条件提出了较高的要求；如果降低水分活度和ｐＨ可以使鲜榨苹果汁在常温条件下也能够抑制致病菌，不但可以降低贮运过程的冷链条件，也节省了能源消耗和贮运费用。在鲜榨苹果汁生产过程中，应根据市场对果汁风味的要求，采用反渗透膜技术对果汁进行浓缩，适当提高果汁的浓度，以降低鲜榨苹果汁的水分活度和ｐＨ；另外，在榨汁苹果原料品种的搭配中适当加大高酸苹果的比例，以提高果汁的酸度增加鲜榨苹果汁的生物稳定性。３

结　　论

沙门氏菌、金黄色葡萄球菌生存概率的影响的实验结果，经Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ　ｖ　６．０统计软件，应用ｌｏｇｉｓｔｉｃ回归过程进行数据处理，得出三种致病菌的生存概率数学模型，结果见表６。经过ｘ２检验数学预测模型拟合度都较高，金黄色葡萄球菌的数学模型拟合度最优，而沙门氏菌和大肠杆菌拟合度相对较低，ｐ＜０．０１均达到显著

表６　　　大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌的logistic回归生存概

率数学模型

Table 6 Equations obtained by fitting the logistic regressionmodel to the growth/no growth data observed for of E.coli,Salmonella enteritidis, Sarcina aurea Henrici. The predictors ofgoodness of fit (likelihood-ratio x2 and P-value) are also reported.致病菌大肠杆菌

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　数学模型

ｐ

ｌｎ（———）＝－１４．６０３３４－２．７１００４７ｌｎ（Ｔ－７．６０）

１－ｐ－３．８０６２９１ｌｎ（ｐＨ－４．１２）－３．８０６２９１ｌｎ（Ａｗ－０．９３６）ｘ２（Ｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ）＝１３．０８５，　　　ｐ＝０．００４４６

ｐ

ｌｎ（———）＝１２７．１５－１８５．４７３８ｌｎ（Ｔ－４．５２）

１－ｐ－１３２．６１１６ｌｎ（ｐＨ－３．９２）－４５．５９０３７ｌｎ（Ａｗ－０．９３８）ｘ２（Ｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ）＝１３．５９０，　　　ｐ＝０．００３５２

ｐ

ｌｎ（———）＝－１８３．１６８４－２４．７４４２８ｌｎ（Ｔ－８．３）

１－ｐ－４６．９６６１５ｌｎ（ｐＨ－４．２）－４２．２９１６１ｌｎ（Ａｗ－０．９３６）ｘ２（Ｃｈｉ－ｓｑｕａｒｅ）＝２０．８３８，　　ｐ＝０．０００１１

沙门氏菌

金黄色葡萄球菌

通过本文的数学处理和实验验证表明，应用ｌｏｇｉｓｔｉｃ

回归过程归纳鲜榨苹果汁中主要致病菌的生存／死亡概率模型是可行的，并且可以对生存临界条件下的生长抑制

下（Ａｗ＝０．９８左右），生存概率ｐ＝０．１时的模型预测等值线可以作为细菌生存的临界线，以此确定鲜榨苹果汁中致病菌的生存临界条件。

微生物的生存或死亡是细胞内各种生化反应的结果，对于生存临界条件下致病菌生理代谢机制有待于作进一步的研究。

参考文献：［１］［２］

ａ

［３］

［４］

［５］

［６］

ｂ

［７］

［８］

［９］

［１０］

ｃ

（图中实线表示ｐ＝０．１时温度、ｐＨ和水分活度交互作用等值线）图２　　　ｐ＝０．１时大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌不同温度、

ｐＨ和水分活度间的交互作用

Fig.2 The interaction of the temperature, pH and Aw (p=0.1)

［１１］

因子间协同作用效果进行定量描述，确定致病微生物生存的控制条件。

生长死亡概率预测模型为确定致病微生物的生存临界条件提供了准确的方法，为在相对温和的条件下加工和贮藏食品，最大限度的保持产品的风味和营养提供了理论依据。

模型预测和实验验证表明，在鲜榨苹果的水分活度

［１２］［１３］［１４］

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Ｐｒｅｓｓｅｒ　Ｋ，　Ｒｏｓｓ　Ｔ，　Ｒａｔｋｏｗｓｋｙ，　Ｄ　Ａ．　Ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈｌｉｍｉｔｓ　（ｇｒｏｗｔｈ／ｎｏ　ｇｒｏｗｔｈ）　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ　ｏｆ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｓ　ａｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｐＨ，　ｌａｃｔｉｃ　ａｃｉｄ　ａｎｄ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ［Ｊ］．　Ａｐｐｌ　ＥｎｖｉｒｏｎＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，　１９９８，　６４：　１７３３－１７９９．

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Ｍ　Ｎ　Ｈａｊｍｅｅｒ，　Ｉ　Ａ　Ｂａｓｈｅｅｒ．　Ａ　ｈｙｂｒｉｄ　Ｂａｙｅｓｉａｎ－ｎｅｕｒａｌ　ｎｅｔ－ｗｏｒｋ　ａｐｐｒｏａｃｈ　ｆｏｒ　ｐｒｏｂａｂｉｌｉｓｔｉｃ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｏｆ　ｂａｃｔｅｒｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ／ｎｏ－ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ［Ｊ］．　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　２００３，　８２：　２３３－　２４３．

Ｔｈｏｍａｓ　Ａ　ＭｃＭｅｅｋｉｎ，　Ｋｉｒｓｔｙ　Ｐｒｅｓｓｅｒ，　Ｄａｖｉｄ　Ｒａｔｋｏｗｓｋｙ，ｅｔ　ａｌ．　Ｑｕａｎｔｉｆｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｈｕｒｄｌｅ　ｃｏｎｃｅｐｔ　ｂｙ　ｍｏｄｅｌｉｎｇ　ｔｈｅ　ｂａｃｔｅ－ｒｉａｌ　ｇｒｏｗｔｈ／ｎｏ　ｇｒｏｗｔｈ　ｉｎｔｅｒｆａｃｅ［Ｊ］．　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆＦｏｏｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，　２０００，　５５：　９３－９８．

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Ｇｉｂｓｏｎ　Ａ　Ｍ，　Ｒｏｂｅｒｔｓ　Ｔ　Ａ．　Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　ｐＨ，　ｗａｔｅｒ　ａｃｔｉｖｉｔｙ，ｓｏｄｉｕｍ　ｎｉｔｒｉｔｅ　ａｎｄ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ａｎｄ　Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｅ　ｉｎ　ａ　ｌａｂｏ－ｒａｔｏｒｙ　ｍｅｄｉｕｍ［Ｊ］．　Ｉｎｔ　Ｊ　Ｆｏｏｄ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，　１９８６，　（３）：　１８３－１９４．

４．０