高效液相色谱-质谱联用法测定可乐中咖啡因的含量
高效液相色谱-质谱联用法测定可乐中咖啡因的
含量
目 录
摘要 . ................................................................................................................................................ I Abstract ........................................................................................................................................ II 引 言 ............................................................................................................................................. 1
第1章 文献综述 ...................................................................................................................... 2
1.1可口可乐与咖啡因的相关研究 ....................................................................................... 2
1.1.1可口可乐简介 ................................................................................................................ 2
1.1.2 咖啡因的简介 ............................................................................................................... 2
1.1.3 咖啡因的药理作用以及注意事项 ............................................................................... 2
1.2 可乐中咖啡因的分析测定方法的研究 .......................................................................... 2
1.2.1 高效液相色谱法 ........................................................................................................... 2
1.2.2薄层色谱法 .................................................................................................................... 3
1.2.3紫外分光光度法 ............................................................................................................ 3
第2章 实验部分 ...................................................................................................................... 3
2.1仪器和试剂 ....................................................................................................................... 4
2.1.1 实验仪器 ....................................................................................................................... 4
2.1.2主要试剂 ........................................................................................................................ 4
2.2 仪器校验 .......................................................................................................................... 4
2.2.1 系统精密度测试 ........................................................................................................... 4
2.2.2 仪器响应线性测试 ....................................................................................................... 5
2.3 实验过程 .......................................................................................................................... 6
2.3.1样品的预处理 ................................................................................................................ 6
2.3.2样品的预试和分析方法的确定 .................................................................................... 6
2.3.3标样的预试和线性梯度的确定 .................................................................................. 10
2.3.4咖啡因的线性标准曲线测定和重现性的测定 . ......................................................... 11
2.3.5回收率的测定 .............................................................................................................. 11
2.3.6样品中咖啡因具体含量的测定 .................................................................................. 11
第3章 实验结果讨论 . .......................................................................................................... 13
3.1系统精密度测试结果 ..................................................................................................... 13
3.2 仪器响应线性测试结果 ................................................................................................ 13
3.3咖啡因的重现性的测定结果 ......................................................................................... 14
3.4咖啡因的线性标准曲线测定结果 ................................................................................. 15
3.5回收率的测定的结果 ..................................................................................................... 16
3.6样品中咖啡因含量的测定结果 ..................................................................................... 16
结 论 ........................................................................................................................................... 17 致 谢 ........................................................................................................................................... 17 参考文献 .................................................................................................................................... 18 附录A 实验测试谱图和数据 . ............................................................................................. 19
A1:系统精密度测试谱图和数据 ...................................................................................... 19
A2:仪器响应线性测试谱图和数据 .................................................................................. 19
A3:咖啡因的重现性测定谱图和数据 .............................................................................. 20
A4:咖啡因的线性标准曲线测定谱图和数据 .................................................................. 20
A5:回收率的测定谱图和数据 .......................................................................................... 21
A6:样品中咖啡因含量的测定谱图和数据 ...................................................................... 21
高效液相色谱-质谱联用法测定可乐中咖啡因的含量
摘要: 本课题使用高效液相色谱-质谱联用仪(HPLC-MS )对可乐中咖啡因的含量进行测定,判断样品可乐中咖啡因的含量是否符合国家标准。首先是对实验所用仪器从仪器响应线性、系统精密度等几个方面进行性能检验 。结果经过计算误差均在要求范围以内,确定仪器性能正常。参考相关文献寻找到适宜的分析方法。检测波长270 nm ,柱温是30℃,流速为0.8 mL/min,通过样品预试确定样品能够提取到咖啡因。然后测定咖啡因标准品的线性,根据数据计算线性回归方程和绘制咖啡因的标准曲线,结果证明在 25~400 μg/mL 的浓度范围内线性关系良好(r=0.9998)。再配置样品标准品混合溶液计算回收率,回收率为98.17%。最后通过高效液相色谱-质谱联用法测定样品可乐中咖啡因的浓度约为100.40µg/mL,符合国家标准。说明高效液相色谱-质谱联用法测定可乐中咖啡因的含量高效、高速、分离效果好。
关键词:可口可乐 咖啡因 高效液相色谱-质谱联用法 分离测定
I
Determination of caffeine content in coke by HPLC-MS
Abstract: In this work, the content of caffeine in cola was determined by HPLC-MS and to determine whether the content of caffeine in the sample is in line with national standards. First of all, the instrument used to test the instrument from the linear response, system precision and other aspects of performance testing. The results are calculated within the required range to determine the normal performance of the instrument. A suitable analysis method was found in the literature. The detection wavelength was 270nm, the column temperature was 30℃ and the flow rate was 0.8mL/min. The sample was able to extract caffeine by sample pre-test. Then determined linearity of the caffeine standard material. The linear regression equation and the standard curve of caffeine were calculated from the data. The results showed that the linear relationship was good (r=0.9998) in the concentration range of 25-400μg/mL. And then the sample standard material mixture solution to calculate the recovery rate, the recovery rate of 98.17%. Finally, the concentration of caffeine in the cola was 100.40μg/mL by HPLC-MS, which was in accordance with the national standard. The results showed that the HPLC-MS for the determination of caffeine content of coke high efficiency, high speed, good separation effect.
Key words:Coca-Cola; Caffeine; HPLC-MS; Separation assay
引 言
可口可乐是黑褐色、甜味的碳酸饮料,它代表青春、活力、生命、时尚,受到了广大青少年群众的喜欢。随着可乐在日常生活中的饮用量越来越高,作为其成分之一的咖啡因也进入了人们的视线。咖啡因是一种中枢神经系统兴奋剂,常用来提神和解除疲劳。每个人能够摄入的咖啡因的剂量主要取决于每个人的体型和对咖啡因的耐受性,并没明确的剂量规定,因此应注意咖啡因的摄入量。一旦过度摄入,咖啡因就会变成一种毒品,能够导致咖啡因中毒。咖啡因中毒包括上瘾和一系列身体和精神上的不良反应。比如:神经过敏、焦虑、失眠。心悸等。所以咖啡因被列入国家一类精神药品管理范围,对于咖啡因的使用有严格的剂量要求,国标要求可乐中咖啡因含量不得超过150µg/mL。 本实验主要采用HPLC-MS 法分离检测可口可乐中咖啡因的含量,看是否符合国家标准。经过试验对比确定最优的分析方法。为以后测定可乐中咖啡因含量留下参考依据,同时为规范我国销售市场贡献自己的一份力量。
第1章 文献综述
1.1可口可乐与咖啡因的相关研究
1.1.1可口可乐简介 中文名称:可口可乐 英文名称: Coca-Cola。
可口可乐中含有丰富的无机盐,夏天喝可乐比单纯喝水要解渴。而且可口可乐是碳酸饮料和高能饮料,能够补充人体所需要的碳水化合物,运动时喝下能够补充体力。
但是可口可乐含有一定量的咖啡因,过多的饮用会让人上瘾。还含有大量的糖,糖分对人体的牙齿发育非常不利,而且容易导致牙齿腐损。同时人体如果对糖吸收过度,会产生大量的热量,长期饮用会导致身材肥胖。可口可乐中还含有磷酸成分,会使人体的骨骼发育会受到影响。
1.1.2 咖啡因的简介
中文名称:咖啡因 英文名称:Caffeine
咖啡因是可口可乐的有效成分之一,它是从咖啡果、茶叶中提取出的一种生物碱。
1.1.3 咖啡因的药理作用以及注意事项 (1)提神醒脑:咖啡因会刺激大脑的中枢神经系统,延长大脑的清醒时间,使人思路清晰,可以提高工作以及学习的效率。
(2)促进消化:交感神经会受到咖啡因的刺激,使人体胃液的分泌过多。若在饭后
适量食用,能够促进人体消化吸收。
咖啡因[1,2]使用注意事项:小剂量咖啡因的摄入能够增加大脑皮质的兴奋程度,减弱疲劳感[3],使人振奋精神,思维敏捷。但是咖啡因大剂量或者长期的摄入会有失眠、躁动不安、昏厥等不良影响。而且咖啡因能够使人上瘾,如果停止使用会出现精神萎靡不振、全身困乏疲软等各种戒断症状[4]。一些研究还认为咖啡因是一种较弱的致突变和致畸物质,会引起局部缺血性心脏病、心律不齐等病症[5]。因此摄入咖啡因时,一定要要适量摄入。
1.2 可乐中咖啡因的分析测定方法的研究
到现在为止,有很多测定咖啡因的方法。如紫外分光光度法、高效液相色谱法、超高效液相色谱法[6-8]、薄层色谱法等。
1.2.1 高效液相色谱法
20世纪70年代发展起来的一项高效、快速的分离分析技术是高效液相色谱法[9-11]。它是指流动相为液体的色谱技术[12 ,13]。先是采用高压输液系统,在色谱柱内将具有不同极性
的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入,然后在色谱柱内成分被分离后,最后进入检测器检测,实现对样品的分析。 武开业[14]用反向高效液相色谱法测可乐中咖啡因的含量。实验使用的方法是可乐经前处理后, 用 Diomonsil C18(2)5u 色谱柱分离, 以甲醇+水混合溶液作为流动相进行洗脱, 在286 nm 波长下进行紫外检测, 一次进样分析为4min 。结果显示咖啡因在 10~150µg/mL 范围内的线性关系良好, 在加标水平为50、80、100µg /mL 时, 回收率为96.8%~101.8%。
刘阳,孙艳丽[15]用高效液相色谱法测定可乐中咖啡因的含量。方法检测波长为286 nm,以去离子水和甲醇以5:5 的体积比为流动相; 流速设定为0.8mL/ min,咖啡因在质量浓度为10~50µg/mL 范围内线性关系良好,相对标准偏差为0.64%。
董悦涵[16]使用高效液相色谱法测可乐中咖啡因的含量。方法波长确定为273nm ,流动相是乙腈∶水=20∶80的比例,色谱柱温度20℃,流速设定为1 mL/min。在0~15µg/mL 的浓度范围线性关系良好(r=0.999 9)。加标平均回收率为 99.69%。
1.2.2薄层色谱法
薄层色谱法(TLC) [17,18]是一种快速分离和定性分析小量物质的实验技术,也经常用来追踪反应的进程。它综合了柱色谱和纸色谱的优点,适用于少量的样品(低至几十微克)和更少量的化合物的分离。我们在制作薄层硅胶板时,可以把薄层板制作的大一些,同时保证硅胶板厚度的均匀,上样时将样品划成一条直线,就可以上样更多的样品,所以也能用来分离纯化某些样品。它适用于沸点低或者较高温度下易发生化学反应却不能用气相色谱分析的物质。这种方法除了用来分离样品外,还可以在化学反应时用来监测反应程度。依据是看原料点的消失及产物点的产生来观察反应是否完全。
1.2.3紫外分光光度法
紫外分光光度法[19,20]是在200~800nm 波长范围内检测物质的吸光度,用于杂质检查和定量测定的方法。当光穿过被测物质溶液时,物质对光的吸收程度随光的波长改变而变化。因此,检测物质在不同波长处的吸光度,并绘制其吸光度与波长的关系图就可以得到被测物质的吸收光谱。通过特定波长范围内样品的光谱与对照光谱或对照品光谱的比较,或通过确定最大吸收波长,或通过测量两个特定波长处的吸收比值而鉴别物质。
综上所述,目前常用的方法中,高效液相色谱-质谱联用法仍是生活中最常用到的方法。HPLC-MS [21-23]具有高速、高灵敏度等特点,运用此法的关键在于根据被测物的物理性质选择合适的分析条件和方法,使可乐中的咖啡因和其它成分得到良好的分离。质谱更多的是与高效液相色谱联用对分离的物质进行分子量的确定,确保分析结果的准确性。
第2章 实验部分
以下为本课题所用的主要的仪器和实验试剂。
2.1仪器和试剂
2.1.1 实验仪器
数控超声波清洗器
KQ-250B 昆山市超声仪器有限公司
2.1.2主要试剂 表2.2 主要实验试剂
试剂名称
可口可乐汽水
乙腈
萘
利血平
三氟乙酸
氨水
咖啡因 试剂类型 饮料 色谱纯 标准品 标准品 分析纯 分析纯 标准品 生产厂家 上海申美饮料食品有限公司 德国默克集团 西格玛奥德里奇(上海) 贸易有限公司 西格玛奥德里奇(上海) 贸易有限公司 北京百灵威科技有限公司 江苏强盛功能化学股份有限公司 西格玛奥德里奇(上海) 贸易有限公司
2.2 仪器校验
在实验开始之前,首先要进行高效液相色谱-质谱联用仪器性能的校验,确保仪器的性能符合标准,避免在实验过程中的可能出现的系统误差,提高检测结果的准确度。
2.2.1 系统精密度测试
首先配置萘的标准溶液。称取20mg 萘的标准品放置于100mL 的容量瓶中,加入乙腈溶
解并定容至100mL ,使用数控超声波清洗器帮助溶解,然后将这个溶液作为储备溶液。随后用移液枪精确吸取1mL 储备溶液置于10mL 容量瓶中,加入乙腈稀释并定容,作为标准溶液。按表2.3的方法取乙腈空白溶液进样一次,进样量为4µL 。取萘的标准溶液进样6次,进样量为4µL ,并记录色谱图。最后计算6针样品中的萘的峰面积和保留时间的平均值和相对标准偏差。接受标准为峰面积的相对标准偏差≤2.0%。保留时间的相对标准偏差≤2.0%。
表2.3 系统精密度测试实验方法
色谱柱 色谱柱温度 流动相 梯度顺序 (可根据不同仪器的不同配置进行调整) Phenomenex Luna 50x2.00mm ,5um 50℃ A: 0.04%三氟乙酸+纯化水 B: 0.02%三氟乙酸+乙腈 Time %B FLow 1 2 3 4 5 6 7 0.00 0.40 3.40 3.90 3.91 4.00 4.50 25.0 0.800 25.0 0.800 100.0 0.800 100.0 0.800 25.0 0.800 25.0 1.000 25.0 1.000 0.8mL/min 220nm 4μL 4.5min 流速 检测波长 进样量 数据采集时间
2.2.2 仪器响应线性测试
首先配置利血平的储备液。精确称取20mg 的利血平的标准品置于100mL 的容量瓶中,用乙腈和水5:5比例配置的溶剂溶解并定容,得到利血平的储备液。然后用移液枪取利血平储备液0.5mL 、1mL 、2mL 、4mL 、5mL 置于10mL 的容量瓶中,用乙腈:水各50%的溶剂稀释定容,得到标准溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ,取利血平储备液作为标准溶液Ⅵ。按表2.4的方法取乙腈和水5:5比例配置的溶剂作为空白对照,进样一次,进样量要求为4µL 。然后分别取上面配置的六个标准溶液依次进样,每个标准溶液进样三次,进样量要求为4µL 。最后以线性测试溶液的浓度为横坐标,峰面积响应值为纵坐标,做出它的线性回归曲线,并计算它的线性回归相关系数。要求线性相关系数(r )≥0.9990.
表2.4仪器响应线性测试实验方法
色谱柱 色谱柱温度 流动相
梯度顺序
(可根据不同仪器的不同配置进
行调整)
Phenomenex Luna 50x2.00mm ,5um
50℃
A: 0.04%三氟乙酸+纯化水 B: 0.02%三氟乙酸+乙腈 Time
%B
FLow
0.00 25.0 0.800 0.40 25.0 0.800 3.40 100.0 0.800 3.90 100.0 0.800 3.91 25.0 0.800 4.00 25.0 1.000 4.50 25.0 1.000
流速 检测波长 进样量 数据采集时间
0.8mL/min 220nm
流通池6mm ,进样量4μL;流通池10mm ,进
样量2μL
4.5min
除了上述两项仪器性能校验外,还做了梯度准确性检验、高压输液泵流速校验和二极管阵列检测器Ho 滤光器波长准确度检查。在进行样品分析时,仪器系统正常,方法合适是确保检测结果准确的必要条件。仪器校验就是为了保证仪器正常,从而使运行的方法与设定的方法一致,保证结果的准确性。
2.3 实验过程
2.3.1样品的预处理
首先需要在市面上随机购买上海申美饮料有限公司一瓶可口可乐,将该可口可乐作为样品溶液。然后将样品可口可乐分别置于两个100mL 的容量瓶中,并定容至100mL 。将这两个装有样品的容量瓶放在数控超声波清洗器中进行超声脱气。超声过程伴随着气泡的冒出容量瓶中的体积会大幅度减少。随后将容量瓶取出继续向内加入样品可乐并定容至100mL 。该过程不断重复直到超声脱气完的样品溶液在两个容量瓶中达到100mL 。将两个容量瓶的样品溶液分别编号为样品溶液Ⅰ,样品溶液Ⅱ。将两个容量瓶放置于通风橱中静置,直到液体表面没有任何气泡
2.3.2样品的预试和分析方法的确定
从样品溶液Ⅱ中取出3mL 样品,再用0.45µL 滤膜过滤,过滤后的样品分3份命名为样品1、样品2、样品3用进样瓶盛装,用高效液相色谱-质谱联用仪进行测定,看能否提
取到可乐中峰咖啡因从而判断样品是否合适。首先用5-95CD 的方法进样。方法信息如表2.5:
表2.5 5-95CD实验方法
色谱柱 色谱柱温度 流动相
梯度顺序
(可根据不同仪器的不同配置进
行调整)
Xbridge 50x2.1mm ,5um
40℃
A: 0.05%氨水+纯化水
B: 乙腈 Time %B FLow 1 2 3
流速 检测波长 进样量 数据采集时间
0.00 5.00 7.00
5.0 0.600 95.0 0.600 95.0 0.600 0.6mL/min 220nm 2μL 7min
图2.1样品1高效液相色谱-质谱图
因为咖啡因的分子量为194,质谱提取的MS 值为MS+1,所以提取195分子量. 根据上图可以知道在195分子量出提取到了物质,说明样品中含有咖啡因。同时对照DAD 检测图谱可以知道在1.122min 时间出的峰便是咖啡因的峰。但是出峰时间太靠前,所以方法不是很合适。接下来对目标峰进行光谱分析。
图2.2 样品1光谱图
通过对样品1分析的光谱图可以知道样品在波长为205nm 、270nm 波长下吸收很好,所以修改方法命名为0-25CD-7min ,对样品2进行检测。
表2.6 0-25CD-7min实验方法
色谱柱 色谱柱温度 流动相
梯度顺序
(可根据不同仪器的不同配置进
行调整)
Xbridge 50x2.1mm ,5um
40℃
A: 0.05%氨水+纯化水
B: 乙腈 Time %B FLow 1 2 3 4
流速 检测波长 进样量 数据采集时间
0.00 5.50 6.50 6.55
0.00 0.800 30.0 0.800 30.0 0.800 0.00 0.800 0.8mL/min 205nm 、270nm
1μL 7min
得到的检测谱图2.3:
图2.3样品2高效液相色谱-质谱图
通过质谱图谱定性可已得知1.859min 出的峰便是咖啡因的峰,通过DAD 检测谱图可以知道波长为205nm 虽然吸收最强,峰面积最大,但是谱图基线十分不稳定。270nm 波长处虽然吸收不如205nm ,但是谱图基线稳定,走出来的峰形也很完美,所以将270nm 作为检测波长。但是出峰时间还是有点靠前,所以再次修改方法命名为0-25CD-7min-WHF ,对样品3进行检测。
表2.7 0-25CD-7min-WHF实验方法
色谱柱 色谱柱温度 流动相
梯度顺序
(可根据不同仪器的不同配置进
行调整)
Xbridge 50x2.1mm ,5um
30℃
A: 0.05%氨水+纯化水
B: 乙腈 Time %B FLow 1 2 3 4
0.00 5.50 6.50 6.55
0.00 0.800 25.0 0.800 80.0 0.800 0.00 0.800 0.8mL/min 270nm 1μL 7min
流速 检测波长 进样量 数据采集时间
得到的谱图2.4:
图2.4样品3高效液相色谱-质谱图
通过质谱图确定2.135min 时出的峰便是咖啡因,而且谱图基线十分完美,出峰时间也适当向后延伸,说明方法比较合适,确定该方法为最终的分析方法。 2.3.3标样的预试和线性梯度的确定
为了测定咖啡因标准品的线性曲线,需要配置一定梯度不同浓度的咖啡因标准品溶液。为了确定合适的浓度梯度,也为了确定方法对于不同样品的重现性是否合适,首先配置了500µg/mL的咖啡因标准品溶液,按照0-25CD-7min-WHF 的方法走样
.
图2.5 500µg/mL的咖啡因标准品高效液相色谱-质谱图
从图2.5中可以看出样品和标样的出峰时间基本一致,说明重现性比较好,所以可以确定2.126分钟左右出的峰形便是我们所需要的提取到的咖啡因的峰。
表2.8 500µg/mL的咖啡因标准品谱图数据
Peak 1
RT (min ) 2.126
SignaL 1 : DAD1 G, Sig=270,8 Ref=off Height Height% Width (min ) 391.255 100 0.073
Area
1705.644
Area% 100
根据表2.8的数据可以知道,波长为270nm 时500µg/mL的咖啡因标准品的峰面积经过积分为1705.44,大概为270nm 时样品中经过积分的咖啡因的峰面积响应值的五倍。所以决定配置25µg/mL、50µg/mL、100µg/mL、200µg/mL、400µg/mL 五个浓度梯度来测定咖啡因的线性标准曲线.
2.3.4咖啡因的线性标准曲线测定和重现性的测定
精确称取40mg 咖啡因标准品,将咖啡因标准品置于100mL 的容量瓶中并用纯水定容至100mL ,通过数控超声波清洗器使咖啡因标准品溶解,在容量瓶上标明浓度(400µg/mL)。从浓度400µg/mL的标准品溶液中取出5mL 置于10mL 的容量瓶中,并用纯水定容至10mL ,用微型旋涡混合仪使其充分摇匀,在容量瓶上标明浓度(200µg/mL)。按照配置200µg/mL浓度的方法继续配置浓度为100µg/mL、50µg/mL 、25µg/mL的咖啡因标准品溶液。
按照浓度梯度从小到大分别将其标号为标准品溶液Ⅰ, 标准品溶液Ⅱ,标准品溶液Ⅲ,标准品溶液Ⅳ,标准品溶液Ⅴ,根据确定的分析方法设置相应的Sequence 序列,在进行样品分析的时候每个浓度的样品需要进样两次,分析完毕后打印出相应的谱图,从谱图中提取自己所需要的数据,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,算出线性方程并做出相应的散点图。其中100µg/mL的咖啡因标准溶液需要进样6次,根据六次的分析结果进行数据计算,判断标准品在六次的测定中的重现性是否良好。 2.3.5回收率的测定
准确称取10mg 咖啡因标准品置于样品标准溶液Ⅰ中,利用数控超声波清洗器使咖啡因标准品溶解。取混合后的样品标准溶液Ⅰ,样品标准溶液Ⅱ各10mL 分别置于10mL 的容量瓶中。用1mL 的针管按次序抽取样品标准溶液Ⅰ,样品标准溶液Ⅱ,然后用0.45µL 滤膜过滤,将过滤后的溶液放置在不同的瓶子中待取。取过滤后的样品标准溶液Ⅰ和Ⅱ各 1mL 分别置于1.5mL 的进样瓶里,命名样品+标样1和样品4。根据确定的分析方法设定相应的Sequence 序列,在进行样品分析时每个进样2针,测定完毕后打印出相应的谱图,从谱图中提取自己需要的数据进行计算。要求回收率在95%以上之间合格。 2.3.6样品中咖啡因具体含量的测定
取样品标准溶液Ⅱ两份,每份1mL 用0.45µL 滤膜过滤后置于1.5mL 的进样瓶中,命名为样品5、样品6。按照确定的分析方法设定相应的Sequence 序列。分析样品时每一个
进样2针,测定完毕后打印出相应的谱图,从谱图中提取自己所需要的数据,然后根据公式进行计算相应的结果。
每当新开始一项项目的测定,如果流动相或者色谱柱发生改变,为了减少系统的误差,保证测量结果的准确度,需要先对仪器进行Purge 。首先将流动相全部换成纯水,开启仪器的Purge 阀门调节泵流速,目的是为了排除流动相中气泡。如果有气泡存在会导致系统压力和紫外波动较大,影响实验准确度。随后将纯水跟换为本次项目的流动相,关闭Purge 阀门,使液体从色谱柱和仪器内部流动,对仪器进行冲洗。目的是为了平衡仪器系统,以确保仪器状态与实际分析方法一致,保证结果的准确性。如果不进行,会导致仪器实际运
行条件与分析方法不一致,导致结果准确度下降以及实验重复性降低。
第3章 实验结果讨论
3.1系统精密度测试结果
表3.1系统精密度测试结果
进样次数
1 2 3 4 5 6 平均值 标准偏差
相对标准偏差(%)
标准(%) 结果
保留时间(min )
2.114 2.114 2.113 2.114 2.114 2.113 2.114 0.001 0.024 ≤2.0 通过
峰面积 2765.416 2770.951 2769.174 2765.229 2765.518 2767.289 2737.263 2.36 0.085 ≤2.0 通过
由附录A1相关图谱的数据进行计算,计算得到表3.1数据结果,可以看到保留时间和峰面积的相对标准偏差全部小于2,所以系统的精密度测试合格。
3.2 仪器响应线性测试结果
表3.2仪器响应线性测试结果
图3.1仪器响应线性标准曲线
由附录A2中相关图谱的数据进行计算,得到表3.2数据结果。可以看到仪器响应性测试合格。如果仪器的线性响应测试不合格,说明该仪器在此浓度范围内线性的关系很差,即使得到相应的数据也无法利用该公式计算出相应的结果。
3.3咖啡因的重现性的测定结果
表3.3重现性结果
根据附录A3中的的图谱和数据的相关信息进行计算得到表3.3数据,计算结果可以知道相对标准偏差十分小,说明样品的重现性十分好。
重现性好说明数据是我们实验需要的数据,也说明仪器的性能和方法都是正确有效
的。如果重现性不好,则无法确定这六个样品测定的结果哪一个才是正确有效的,这个数据就无法采用。需要我们从仪器、方法、样品各个方面排查问题,重新测定直到重现性达到要求。导致重现性不好的原因有泵流速不准确、进样量不准确、方法不合理等。
3.4咖啡因的线性标准曲线测定结果
根据附录A4中谱图及相应的数据信息进行计算得到表3.4结果:
表3.4咖啡因的线性关系测试结果
图3.2咖啡因标准曲线
由图3.2可知,咖啡因的线性关系十分好,误差在允许的范围之内。
线性是为了确保我们实验中的样品浓度和标准品浓度以及响应之间是在线性范围内的,从而可以通过标准曲线进行测定。如果线性关系不好,说明咖啡因在此浓度内的线性
很差,得到的数据就无法带入该线性方程计算浓度。如果线性很好,但是数据代入以后偏离曲线很多,说明样品、方法、仪器等方面出现了问题,需要重新测定。
3.5回收率的测定的结果
表3.5回收率测定结果
样品4 样品+标样1
第一次进样峰面积
332.452 655.021
计算结果
实际配置标准品浓度(µg/mL) 计算的标准品浓度(µg/mL)
回收率
100 98.17 0.9817
第二次进样峰面积
332.140 656.758
平均峰面积 332.296 655.890
根据附A5中谱图及相应的数据进行计算得到表3.5内的结果,回收率为98.17%,达到要求。回收率是为了实验的准确度,证实系统、方法以及实验人员操作过程是可信的,准确的,从而证明我们的检测结果是准确的,可信的。如果回收率太低,但是其他方面都正常,说明方法不合适。
3.6样品中咖啡因含量的测定结果
根据附录A6中的图谱和数据的相关信息进行计算得到表3.6数据:
表3.6样品中咖啡因含量的测定数据
样品5 样品6
第一次进样峰面积
331.326 331.319
第二次进样峰面积
331.137 331.634
平均峰面积 331.232 331.477
表3.7样品中咖啡因含量的计算结果
样品5 样品6
计算浓度结果(µg/mL)
100.379
100.450
300mL 样品咖啡因含量
(mg) 30.114 30.135
表3.6和表3.7计算数据可知样品中咖啡因含量大概为100.40µg/mL,300mL 样品中咖啡因总含量为30mg 左右。该可乐中咖啡因含量符合国家标准。
结 论
本文以市面上所售可口可乐为研究对象,首先通过柱色谱分离其组分,然后通过质谱确定我们所分离出的咖啡因的组分,最后根据计算出的咖啡因标准品的线性回归方程计算出样品可乐中咖啡因的浓度,进而计算样品可乐中咖啡因的含量。
建立了高效液相色谱法测定可乐中咖啡因的测定条件:采用Xbridge-C18色谱柱, 以纯水+0.05%氨水为流动相A 相,纯乙腈为流动相B 相,检测波长为270nm ,柱温30℃,流速为0.8 mL/min,进样量为1μL。
前景与展望:本文主要目的是测定可乐中咖啡因的含量,其中用到高效液相色谱仪、质谱仪。通过测定的数据计算样品可乐中咖啡因含量符合国家标准,为规范我国市场贡献自己的一份力量。由于条件有限,方法未做太多的优化,往后可以通过实验对上述分析条件进行进一步优化,寻找到更加方便快捷、准确的方法。
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附录A 实验测试谱图和数据
由于本实验数据过多,仅选取部分谱图和数据以作示例。
A1:系统精密度测试谱图和数据:
表A1: 20µg/mL萘标准品高效液相色谱-质谱数据表 SignaL 1 :1 DAD1 E, Sig=220,8 Ref=off Height Height% Width (min ) 1102.926 100 0.038
Peak
1 RT (min ) 2.114 Area 2765.416 Area% 100
图A1:20µg/mL萘标准品高效液相色谱-质谱图
A2:仪器响应线性测试谱图和数据:
表A2: 10.23µg/mL利血平标准品高效液相色谱-质谱数据表
Peak 1
RT (min ) 1.599
SignaL 1 :1 DAD1 E, Sig=220,8 Ref=off Height Height% Width (min ) 122.403 100 0.03
Area
244.469
Area% 100
图A2:10.23µg/mL利血平标准品高效液相色谱-质谱图
A3:咖啡因的重现性测定谱图和数据:
表A3: 100µg/mL咖啡因标准品高效液相色谱-质谱数据表
SignaL 1 : DAD1 G, Sig=270,8 Ref=off Height Height% Width (min ) 70.437 100 0.073
Peak 1 RT (min ) 2.125 Area 322.85 Area% 100
图A3:100µg/mL咖啡因标准品高效液相色谱-质谱图
A4:咖啡因的线性标准曲线测定谱图和数据:
表A4: 25µg/mL咖啡因标准品高效液相色谱-质谱数据表
Peak
1
SignaL 1 : DAD1 G, Sig=270,8 Ref=off Height Height% Width (min ) 17.059 100 0.079
Area 80.765
Area% 100
RT (min ) 2.127
图A4:25µg/mL咖啡因标准品高效液相色谱-质谱图
A5:回收率的测定谱图和数据:
表A5: 样品4高效液相色谱-质谱数据表
SignaL 1 : DAD1 G, Sig=270,8 Ref=off Height Height% Width (min ) 8.139 9.839 0.064 Peak 1 RT (min ) 0.679 Area 33.377 Area% 9.124 图A5:样品4高效液相色谱-质谱图
A6:样品中咖啡因含量的测定谱图和数据:
表A6: 样品5高效液相色谱-质谱数据表 SignaL 1 : DAD1 G, Sig=270,8 Ref=off Height Height% Width (min ) 8.077 9.857 0.063 73.86 90.143 0.075
Peak 1 2 RT (min ) 0.681 2.134 Area 32.784 331.326 Area% 9.004 90.996
图A6:样品5高效液相色谱-质谱图