二维电泳步骤
双向电泳 细胞样品的制备
收集、裂解0、100μM Res作用24h 的A549细胞:
(1) 倒净培养基,冷PBS 洗涤3遍;
(2) 250mM 蔗糖溶液洗涤3遍,吸净蔗糖溶液;
(3) 加入临时配好的裂解缓冲液(每100μl Lysis Buffer 加入DTT 1μl和 pharmalyte 2μl),刮刀轻轻刮取细胞,装入EP 管中,冰上裂解30 min;
(4) 离心(10000rpm ,10min ,4℃)后收集上清蛋白样品。
以上操作均在4℃条件下进行。 细胞全蛋白除盐
(1) 混匀蛋白样品和2%脱氧胆酸钠,按99:1的比例,冰上放置30min 。
(2) 加入100%TCA到样品中,使TCA 终浓度为15%,涡旋30sec ,防止形成大的沉淀物。
(3) 蛋白样品在-20℃冰箱中沉淀过夜。
(4) 15000*g下离心10min ,吸出TCA 和已经溶解的物质。
(5) 无水乙醇冰浴清洗蛋白,过程中尽量把蛋白沉淀打碎,可以涡旋30min ,在室温放置5min 。
(6) 15000*g下离心10min ,吸出上清液倒掉。
(7) 重复无水乙醇冰浴清洗蛋白过程三次,在室温放置到蛋白快干,加入裂解液溶解蛋白。
Bradford 法测定蛋白浓度
(1) 将蛋白标准品(0.5mg/mlBSA,牛血清白蛋白)取出复温至完全溶化;
(2) 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20 μl加入96孔板中,用PBS 补足至20μl;
(3) 将适量体积样品加入至96孔板中,加PBS 补足至20μl;每个样品做平行孔3个;
(4) 每孔加入200μl 考马斯亮蓝G250染色液,室温振荡3~5min ;
(5) 用酶标仪测定630nm 吸光度,以OD630为X 轴、标准蛋白浓度为Y 轴制作标准曲线,根据标准曲线计算样品蛋白浓度。
第一向等电聚焦(IEF )
(1) 样品水化:
a. 根据计算好的样品上样体积计算上入槽内的混合膨胀液RS 总体积,将现配的RS (每100μl Rs Buffer 加入DTT 1μl和 pharmalyte 0.5μl),平铺在膨胀槽内(根据胶条长度);
b. 从冰箱取出胶条,撕开胶条上的膜,膜面朝上、胶面朝下慢慢放入铺有RS 的槽段(尽量避免产生气泡),来回轻轻拉动胶条,使胶条均匀覆盖样品; c. 滴上石蜡油覆盖胶条,盖上盖子膨胀12-20h (注意调好膨胀槽至水平位)。
(2) 电泳:
a. 准备好滤纸、蒸馏水、剪刀等,剪好适当长度的滤纸条,用蒸馏水湿润; b. 取出膨胀好的胶条,用超纯水冲洗3遍,滤纸吸干,放入电泳槽内,将湿润的滤纸条放在胶条两端(注意滤纸条要和胶条接触),对齐后加上电极,压紧滤纸,滴上石蜡油覆盖胶条,设置好电泳的梯度电压和温度进行等电聚焦电泳;
c. 水浴箱调至15℃,电压梯度为50V 、1h ;1000V 、1h ;10000V 、4h ;10000V 、200000V-h ;1000V 、24h ;
(3) 胶条的平衡:取出电泳槽内的胶条,放入装有平衡液的离心管中平衡40 min(其中先在DTT 平衡液中平衡15 min,后在IAA 平衡液中平衡25 min)。 第二向SDS 电泳
(1) 按下表配好14%分离胶
Table 2 Recipe for SDS polyacrylamide gel
溶液成分 14%分离胶(ml )
水 31.8
30%丙烯酰胺溶液,0.8%甲叉 56
1.5mol/L Tris-cl(PH 8.8) 30
10% SDS 1.2
10% AP 1.2
TEMED 0.048
Total 120
(2) 取出平衡好的胶条,用1×SDS 电泳缓冲液冲洗胶条3遍,放入灌好已聚合
的分离胶上,用0.5%琼脂糖(加溴酚蓝)封胶(注意避免胶条与分离胶接触面产生气泡),待琼脂糖凝固后调恒流电泳(先调15 mA/gel跑30 min,再调30 mA/gel跑至溴酚兰迁移至底部时终止电泳);
(3) 电泳结束后,取出凝胶放入盒内进行银染(步骤如下):
Silver Staining Protocols for Proteins in SDS-PAGE and 2D
Solution
1.Fixation Time(min) 30 Composition(100ml) Ethanol 40ml
Acetic Acid 10ml MilliQ water 50ml
2.Incubation 30 Ethanol 30ml
Na Acetate anhydrous 4.1g
Na Thiosulfate 0.32g
3.Washing
4.Silver Nitrate 3×10 40 dd H2O Silver Nitrate 0.15g
Formaldehyde 50μl
5.Development 15 Na-carBonate 2.5g
Formaldehyde 50μl
6.Stop Solution
7.Washing
8.Preservation
(4) 扫描,分析结果。 双向电泳经过Amersham 凝胶扫描仪扫描,ImageMaster
Platinum 7.0双向电泳软件分析。挑选有差异的点做胶内酶切,质谱分析鉴定蛋白。
10 3×5 Acetic Acid 5ml dd H2O dd H2O