不同品种茶叶有效成分及香气特征的比较分析

不同品种茶叶有效成分及香气特征的比较分析

张健*，章苏宁，田怀香，宋晓秋，刘艳杰，王犀

上海应用技术学院香料香精工程与技术学院 （上海 200235）

摘 要 采用高效液相色谱及电子鼻测定分析不同茶叶中的有效成分及香气特征。采用C18色谱柱，以甲醇和水（甲醇∶水=3∶7）为流动相对茶叶进行咖啡因分析，以甲醇和三氟乙酸水溶液(甲醇∶水∶三氟乙酸=25∶75∶0.05)为流动相进行儿茶素分析，紫外检测波长280 nm。分别建立标准曲线，比较各种茶叶中有效成分的差异。发现雪水云绿的咖啡因、表儿茶素、表儿茶素没食子酸酯的含量在所测茶叶样品中最高，分别达到4.3%、2.0%和7.5%。电子鼻测试的结果表明，用电子鼻指纹图谱可以有效区分不同品种茶香气相似性和不同之处。

关键词 高效液相色谱法；电子鼻；咖啡因；儿茶素；茶叶

Comparative Analyses of Active Ingredients and Characteritstic Fragrances in Camellia sinensis Teas of Different Processing Methods

Zhang Jian*，Zhang Su-ning，Tian Huai-xiang，Song Xiao-qiu，Liu Yan-jie，Wang xi School of Perfume and Aroma Technology, Shanghai Institute of Technology (Shanghai 200235)Abstract High performance liquid chromatography(HPLC) were used to analyze the active ingredients in Camellia sinensis teas of different processing methods in this article. Caffeine can be separated from other components on a Spherigal C18collumn with methanol and water (methanol /water =3/7) as mobile phase. Catechins can be separated from other components on a Spherigal C18collumn with methanol and TFA solution (TFA/water=0.05/75)as mobile phase. The UV detection wavelength was set at 280 nm of all. Standard curves were made for determine content. Content of Caffeine、EC and EGC in the green tea of “Xue Shui Yun Lv” is highest therein the selected Camellia sinensis sample and reach 4.3%, 2.0% and 7.5% respectively. Fragrance characteristic can be differentiate by the Electronic Nose（EN）for their similarities and differences in different Camellia sinensis.

Keywords high performance liquid chromatography；electronic nose；caffeine；catechin；Camellia sinensis

茶叶为山茶科植物茶的芽叶，茶叶中经分离鉴定的已知化合物有500多种，其中有机化合物有450种以上，构成这些化合物的基本元素有30种[1-4]。茶叶中不仅含有丰富的维生素和矿物质，而且含有许多对人体有保健作用的功效成分如茶蛋白、茶多酚、茶多糖、咖啡因、茶叶皂甙、γ-氨基丁酸、茶氨酸、茶色素等。茶叶中含有多种生理活性物质，特别是近年来研究发现儿茶素类物质有抗癌活性，具有很大的开发利用价值[5-8]。而绿茶、红茶、花茶和乌龙茶等不同的茶叶由于它们不同的产地和制作过程，导致其中的活性物质含量的不同。本文通过使用高效液相色谱及电子鼻分析不同品种的茶叶咖啡因及儿茶素类有效成份和香气指纹特征的异同。1 材料与方法1.1 仪器与试剂

高效液相色谱仪1100：美国安捷伦公司；电子鼻FOX400：法国Alpha Mos SAC（中国）有限公司；数据恒温水浴锅W201B：上海申胜生物技术有限公司；电子天平FA604A：上海精天电子仪器有限公司；移液枪Digital Pipette，Witopet，Germany；超声

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波震荡ULTRASUNICS，JL-60DTH；超纯水制备器ILLIPORE：Simplicity。

咖啡因标准品：中国药品生物制品检定所；表儿茶素(EC)标准品：Fluka；表没食子儿茶素(EGC)标准品，表儿茶素没食子酸酯(ECG)标准品，表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）标准品：Sigma公司；甲醇(色谱纯)；三氟乙酸(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司。1.2 原料

铁观音：福建安溪；祁门红茶：安徽祁门；茉莉龙珠：福建福州；乌龙：福建安溪；黄山炒清：安徽黄山；黄山毛峰：安徽黄山；碧螺春：江苏苏州；雪水云绿：浙江开化；龙井：浙江嵊县；银针茶：广西上林大明山；毛尖：河南安阳。1.3 标准溶液配制

（1）咖啡因标准溶液配制

准确称取咖啡因标准品4.9 mg于10 mL容量瓶中，用高纯水溶解，常温下定容至10 mL，得到质量浓度为0.49 mg/mL的标准品储备溶液。用移液枪将标准品储备液与水混合，配成浓度为0.049 mg/mL、

基金项目：上海应用技术学院科研重点项目资助（编号：KJ-2008-16）。

0.098 mg/mL、0.196 mg/mL、0.294 mg/mL的系列标准溶液，为作标准曲线图备用。

（2）儿茶素类标准品溶液配制

准确称取表儿茶素(EC)标准品11.0 mg、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)标准品9.7 mg、表没食子儿茶素(EGC)标准品13 mg及表儿茶素没食子酸酯(ECG)标准品10mg分别置于10 mL容量瓶中，用高纯水溶解，在常温下定容至10 mL，分别得到质量浓度为1.1 mg/mL、0.97 mg/mL、1.3 mg/mL及1.0 mg/mL的标准品储备溶液。用移液枪将标准品储备液与水混合，准确配成为一系列浓度标准溶液，为作标准曲线图备用。

1.4 样品处理

称取用碾钵捣碎的茶样品各400 mg，倒入圆底烧瓶中，加入40 mL蒸馏水浸泡，置于95℃的恒温水浴锅中，水浴加热120 min，过滤，定容到50 mL容量瓶。1.5 色谱条件

咖啡因测定色谱条件：流动相为水∶甲醇=70∶30色谱柱：C18柱，即十八烷基硅烷键合硅胶(5 µm，250 mm×4.6 mm，安捷伦 Agilent ZORBAX SB-C18)；流速：1.0 mL/min；紫外检测波长：280 nm；柱温：30℃。

儿茶素类物质测定色谱条件：流动相：用移液管准确吸取0.1 mL三氟乙酸，加入1500 mL去离子高纯水，配制成体积比水∶三氟乙酸＝75∶0.05的三氟乙酸水溶液，用超声波除去气泡备用，与甲醇一起用作为流动相。色谱柱：C18柱，即十八烷基硅烷键合硅胶(5 µm，250 mm×4.6 mm，安捷伦 Agilent ZORBAX SB-C18)；流速：0.8 mL/min；紫外检测波长：280 nm；柱温：30℃。[9]

样品中待测物含量计算：

样品中待测物质的含量（%）=[(C×100)/(M×1000)]×100

式中：C—茶汤样品的儿茶素类物质浓度；M—样品质量。

1.6 茶叶的气味指纹分析

样品用碾钵磨碎，精确称量每种茶叶样品，每种，称取三组，用于平行测试。分别称入电子鼻专用的检测瓶中，称量后立即压盖。所有样品称取完成后放入仪器检测平台进行检测。分析参数：载气为合成干燥空气；流速150 mL/min；产生时间600 s；产生温度50℃；搅动速度500 r/min；顶空注射参数Headspace injection；注射体积300 µL；注射速度300 µL/s；注射针总体积2.5 mL；注射针温度70℃。2 结果与讨论

2.1 茶叶中咖啡因分析

2.1.1 咖啡因标准曲线的测定

将不同浓度的咖啡因标准溶液按1.5中咖啡因的色谱条件进行进样分析。以咖啡因标准品的质量浓度

为横坐标X(mg/mL)，峰面积Y（mAU）为纵坐标作图，得到线性回归方程，标准曲线见图1，公式见表1（1），相关系数为0.999 8。

图1 咖啡因标准曲线

2.1.2 样品中咖啡因的测定

测定样品黄山炒清、黄山毛峰、碧螺春、雪水云绿、龙井、大明山银针茶、毛尖、铁观音、明日夜、祁门红茶、茉莉龙珠、乌龙中的咖啡因含量。

根据标准品的出峰时间和样品在相应时间出峰的峰面积与标准曲线相对比，得出样品中相应的含量。咖啡因标准品及样品液相色谱见图2（a）及（b），绿茶和红茶的咖啡因含量相对与花茶和半发酵茶要多，其中雪水云绿含量最高，为4.3%。

（(a)咖啡因标准品色谱图 (b)龙井的色谱检测图）

图2 咖啡因标准品及样品高效液相色谱图2.2 茶叶中儿茶素类物质分析

茶叶中的儿茶素(Catechins)属于黄烷醇类化合物，是茶叶中多酚类物质的主体成分。 2.2.1 待测物质标准曲线

实验将表儿茶素(EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、表没食子儿茶素(EGC)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)标准溶液按1.5色谱条件进样分析。以EC、EGCG、EGC、ECG标准品的质量浓度为横坐标X(mg/mL)，峰面积Y(mAU)为纵坐标作图，得儿茶素类物质的线性回归方程，公式见表1(2)~(5)。检测波长为280 nm时的EC、EGCG、EGC、ECG标样的HPLC图谱见图3，由标准品的出峰时间可知对应的标准品出峰次序依次为EGC 7.5 min、EGCG 12.7 min、EG 16.4 min、ECG 28.1 min。标准曲线见图4。

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前处理方法才能再进行检测，被选茶叶样品中不含ECG可能性也存在，此外可能由于物质不是非常稳定的存在与茶汤中，加上样品茶汤存放时间的关系使此类物质分解而无法检出。

（出峰顺序依次为EGC7.5min、EGCG12.7min、EC16.4min、ECG28.1min）

图3 儿茶素类标准品高效液相色谱图表1 茶叶中五种待测物质标准曲线公式

化合物CaffeineECEGCEGCGECG

标准曲线Y=22713.5X-84.49Y=3760.3X-0.57Y=847.24X-5.21Y=6864.1X+47.47 Y=8055.4X-34.66

相关系数(r2)

线性范围 (µg/mL)

曲线标号（1）（2）（3）（4）（5）

0.999830-3000.999910-1500.9972 10-1500.998910-1500.998010-150

图6 不同品种茶样品中有效物质的含量

图6是被测物质在茶叶样品中所占茶叶干重的含量，显示不同种类的茶叶样品中均含有咖啡因、EC和EGC，对同一茶叶样品来说多是EGC含量最高，咖啡因含量次之，EC含量最少。结果显示绿茶和红茶的咖啡因含量相对与花茶和半发酵茶要多，其中雪水云绿含量最高；EGCG只在祁门红茶中测出，含量为茶叶干重的0.05%。EC在各样品中含量相差不大；EGC在样品雪水云绿中含量最高，在祁门红茶、黄山毛峰和乌龙中含量较低，在绿茶中除了黄山毛峰较低，其他的样品比较接近，结果显示在花茶中EGC含量也较高。

2.3 茶叶中气味特征的区分

(a)表儿茶素EC，(b) 表没食子儿茶素没食子酸酯EGCG，(c)表

没食子儿茶素EGC，(d) 表儿茶素没食子酸酯ECG

图4 儿茶素类物质标准曲线

2.2.2 样品中儿茶素类物质分析

图7 绿茶与其它品种茶叶的香气判别比较以电子鼻及所带的18个传感器分析各种茶叶中特征气味，由图7可见，不同品种的茶叶可以被电子鼻区分出来，7个绿茶集中在图上的圈内，能与红茶、乌龙茶和花茶明显区分。绿茶为我国产量最大的茶类，产区分布于各产茶省、市、自治区。而不同绿茶之间虽然相对接近，但每种绿茶的香气特征仍然不同，可以在图上区分开来。3 结论

通过使用液相色谱法对咖啡因的检测发现：绿茶的咖啡因含量多数在3%以上，其中雪水云绿最多含量达4.3%，红茶中咖啡因含量也比较高，达到3.62%，而半发酵类的乌龙和花茶则相对略低，都在3%以下。检测结果提示如果要从茶叶中提取咖啡因，应该使用绿茶或红茶，可以提高咖啡因得率。

用高效液相色谱法检测红茶、绿茶、花茶、乌龙

（此图例为绿茶雪水云绿）

图5 茶叶样品的液相色谱图

对样品黄山炒清、黄山毛峰、碧螺春、雪水云绿、龙井、大明山银针茶、毛尖、铁观音、祁门红茶、茉莉龙珠、乌龙进行分析。根据样品在相应标准品时间出峰的峰面积代入回归方程，得出相应的含量。图5为茶叶样品的色谱图，与标准品进行对照表明，7.5 min为EGC的对应出峰；16.4 min处为EG对应出峰；在所测定的茶汤样品中28.1 min ECG标准品的出峰位置都没有相应出峰，表明此提取条件茶汤样品中未能检出ECG。分析原因可能有是直接用茶汤检测被测物质时其含量低于仪器检测量，需要使用富集的

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液相色谱法测定风味饮料中甜蜜素含量

苏建国

淮安市产品质量监督检验所 （淮安223001）

摘 要 建立了高效液相色谱法测定风味饮料中甜蜜素检测技术。实验采用次氯酸衍生，AQ-C18色谱柱(250mm×4.6mm, Ultimate)分离，以0.02 mol/L的乙酸铵和甲醇（90∶10）为流动相，流速为1.0 mL/min，柱温25℃，二极管阵列检测器在波长314 nm进行检测。整个分离过程在7 min内完成。甜蜜素的回收率为99.6％～100.4％，相对标准偏差小于0.73%。方法快速准确。关键词 液相色谱法；甜蜜素；风味饮料

Determination of Sodium Cyclamate in Flavored-Beverage by HPLC

Su Jian-guo

Huai An Institute of Supervision and Inspection on Product Quality (Huai’an 223001)

Abstract A HPLC method is proposed for the determination of flavored-beverage, use hypochlorous acid derivative.The separation was achieved within 7 min by using a AQ-C18 column (250mm×4.6mm, Ultimate) with 0.02 mol/L NH4Ac-methanol (90∶10) as mobile phase and column temperature was 25℃, lastly detected at 314nm through a photo-diode array detector. The average recoveries for real samples ranged from 99.6%～100.4%. The relative standard deviation is less than 0.73%. The method is rapid and accurate.

Keywords HPLC; sodium cyclamate; fl avored-beverage一些风味饮料（即果味饮料）存在超量或滥用食品添加剂的现象，甜蜜素超标现象在一些劣质的风味饮料中屡见不鲜。甜蜜素[1]是一种常用甜味剂，化学名称为环己基氨基磺酸钠。风味较自然，后苦不明显，热稳定性高，是不被人体吸收的低热能甜味剂。目前，检测甜蜜素的方法普遍采用气相色谱法，亚硝酸衍生法[2]，前处理时间较长，至少需要30 min，而

本实验方法研究次氯酸衍生，液相色谱测定风味饮料，前处理时间只需要10 min，大大节约分析时间，且结果准确。1 试验部分 1.1 仪器与试剂

VARIAN ProStar 335 液相色谱仪：美国瓦里安公司；检测器：二极管阵列检测器（DAD）；色谱柱：

茶等茶叶中儿茶素类物质简便、实用，可以推广运用在各种茶叶中儿茶素的测定。同时通过测定发现，没食子儿茶素（EGC）和表儿茶素（EC）可以在茶汤中被检测出来，而表儿茶素没食子酸酯（ECG）和表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）则检测不到可能是因为在试验中直接用茶汤检测，待测物浓度太低，可考虑在前处理中浓缩被测样品来达到检测限。尽管如此，从没食子儿茶素（EGC）和表儿茶素（EC）在茶叶中的含量可以看出绿茶都普遍含量高于红茶和半发酵茶。所以绿茶在对这些物质的开发利用上更有积极意义。不同品种的茶叶香气特征各不相同，可以被电子鼻区分出来，此法不仅可用于品种判别，还能在保质期研究以及品种优化等方向发挥作用。

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