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第八节
受体的放射性配体结合分析
（radioligand binding assay of receptors, RBA）
一、总 论
RBA
原理是基于放射性核素标记的配体与特异受体的理化结合反应。
应用放射性标记配体和组织、细胞或含有受体的制剂一起温育，使受体和配体充分结合，形成受体-配体复合物，终止反应后，用过滤或离心的方法除去未被结合的标记物，测定受体-配体复合物的放射性，经过数据处理，可求得受体对配体的亲和力和受体的最大结合容量。
RBA 的分类
定量RBA
可以测定靶组织或靶细胞中能与配体结合的受体数（以结合位点数表示）及研究受体的亲和力（常以平衡解离常数表示）。
定性RBA
发现和确定新的受体和受体亚型，及在分子水平研
究受体-配体的相互作用等。
二、概 述
2. 受体与配体结合的基本特点
1）可饱和性(saturability)
2）特异性(specificity)
3）适度的亲和力（affinity ）
4）可逆性(reversibility)
5）识别能力(recognition)和生物效应的一致性
亲和力：受体与配体的结合能力。
平衡解离常数（equilibrium dissociation constant，KD ）
指占据半数受体所需的配体浓度。
三、单位点系统RBA 的基本规律
（一）简单单位点系统受体和配体结合反应的基本规律
1. 质量作用定律
k1,v1
[R] + [L] [RL]
k2,v2
根据质量作用定律：
v1 = k1 [R] [L]
v2 = k2 [RL]
当反应达到平衡后，
v1 = v2
即： k1 [R][L] = k2 [RL]
则平衡解离常数（KD ）的数学表达式（1.1）为：
KD ＝ k2 ＝ [R][L]
k1 [RL]
2. 饱和曲线(saturation curve)
1）饱和曲线
当配体的浓度从零开始上升时，形成的复合物也逐渐增多。但由于受体数量有限，又是可逆反应，因此[RL]的增加不是直线上升，而是一条上升先快后慢的曲线，最后绝大部分受体与配体结合时，[RL]的增加就非常缓慢，渐趋水平，即受体已经饱和了，此即饱和曲线 。
2）设[LT]为配体的初始浓度，[RT]为受体的
初始浓度，则有：
[L] = [LT] – [RL]
[R] = [RT] – [RL]
将上式代入(1.1)式，经整理得：
[RL]2-[RL]{[RT]+[LT]+KD}+[RT][LT]=0
3. Scatchard作图
由式（1.1）整理可得：
KD ＝ [RT-RL][L]
[RL]
将上式整理可得：
[RL] = [RT] － 1_ × [RL]
[L] KD KD
（二）非特异性结合
(non-specific binding，NSB)
NSB
在RBA 系统中，放射性配体除与受体特异性结合外，还可与其他成分（如非特异蛋白、反应容器、分离材料等）结合。
四、RBA 的基本方法
离体RBA 的基本方法可概述如下：
1. 制备待测受体的离体标本（组织切片、细胞悬液、细胞组分的分离制备等）
2. 加样（标本、放射性标记配基、缓冲液、非标记配基等）
3. 温育
4. 分离结合和游离的放射性标记配体
5. 测定结合部分的放射性
6. 数据处理
五、定量RBA 的数据处理
定量RBA 主要是通过已知标记配体的量和比活度，以及测得的样本的数据，应用数学模型求出受体的有关参数如受体密度[RT]、KD 等。
1. 单点法实验的数据处理
通常是计算饱和区的受体密度，即受体最大结合容量（maximum binding capacity，Rmax ）。
单点法实验只适用于简单单位点系统，其计算公式如下：
[RT] = _____________RL的cpm______________ 探测效率（％）×配体比活度×标本的蛋白量（DNA 量）或细胞数
2. 简单单位点RBA 的多点法实验
简单单位点饱和曲线的数据处理
1. Scatclaard 模型
以复合物浓度[RL]为横坐标，以复合物浓度和游离配体的浓度比值[RL]/[L]为纵坐标作图，实际应用时，[RL]/[L]的浓度比值由放射性的比值B/F代表。
具体公式如下： ：
[RL] = B = [RT] － 1_ × [RL]
[L] F KD KD
2. 计算机曲线拟合
饱和曲线的直接表达式为：
[RL]2-[RL]{[RT]+[LT]+KD}+[RT][LT]=0
复 习 题
1. 受体和配体结合的特点
2. RBA的概念、原理