一种快速药敏试验方法
２００７年第
２９卷第１６期ＣｈｉｎａＰｏｕｌｔｒｙＶｏｌ．２９，Ｎｏ．１６．２００７
一种快速药敏试验方法
廖诗英，王明成，杨玉容（黄淮学院，河南驻马店
４６３０００）
由于滥用抗生素和饲料中长期添加低剂量的抗生素，导致细菌的耐药性越来越普遍、越来越严重，仅凭以往的经验用药往往无效，因此药敏试验显得至关重要。然而传统的纸片法药敏试验耗时较长不能适应临床治疗的迫切性，在一定程度上也限制了药敏试验的普及。如何在不降低试验准确性的同时缩短药敏试验的时间，以便于及时选用有效的抗菌药物控制病情，是广大养殖场和基层兽医站的迫切期望。为此，我们在改进传统药敏试验的基础上，设计了一种快速、简便的ＴＴＣ显色琼脂药敏试验方法，并在临床药敏试验中取得了理想的效果，现介绍如下。
２．１．２药敏片的制备
细菌药敏试验中使用的药敏片目前市场上已
有较多厂家的产品销售。但也可根据需要自制，具体自制的方法如下：取新华１号定性滤纸，用打孔器打成６ｍｍ直径的圆形小纸片。取圆纸片５０片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经１５磅１５～２０ｍｉｎ高压消毒后，放在３７℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。按每张纸片饱和吸水量为０．０１ｍＬ计，在上述含有５０片纸片的小瓶内加入药液０．５ｍＬ，不时翻动，使滤纸片将药液均匀吸净，一般浸泡３０ｍｉｎ即可。同时在瓶口上记录药物名称，放３７℃温箱内过夜，干燥后即密盖。置阴暗干燥处存放，有效期４～６个月。
药液的制备：抗菌药的稀释剂通常用无菌的蒸馏水。一般可按商品药使用说明书上的配料或饮水浓度，按１ｇ需加多少毫升水或配多少毫克饲料，就相当于配制药液所加蒸馏水的毫升数。如５ｇ药物可配５０ｋｇ饲料，其换算方法为：１ｇ本品加１００００ｍＬ蒸馏水。此溶液即为用于做药敏试验的药液。如所加蒸馏水量较大，可按倍比稀释法稀释。
１原理
与传统纸片法在普通琼脂上进行药敏试验不同，本方法使用的是含０．００５％２，３，５－氯化三苯四氮唑（ＴＴＣ）的显色培养基，细菌在生长繁殖过程中可产生琥珀酸脱氢酶，使无色的ＴＴＣ还原为红色物质（三苯基甲替），使培养基变红；而药敏片周围有抗菌素存在抑制了细菌的繁殖，ＴＴＣ指示剂不被还原、不显色，形成对比鲜明的抑菌圈，所以能较早判读抑菌圈的大小。
２．２试验操作方法
在超净工作台中或酒精灯旁，用无菌棉签或
２材料与方法２．１材料
２．１．１ＴＴＣ显色琼脂培养基的制备
先按常规法制作普通琼脂培养基，再按１００ｍＬ琼脂加入０．５ｍＬ１％ＴＴＣ溶液，１０磅３０ｍｉｎ灭菌后，倾注于平皿中备用。
经酒精灯火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌均匀涂布到ＴＴＣ显色琼脂培养基上。然后用无菌镊子取药敏片贴到平皿培养基表面并轻压，使纸片与培养基表面完全接触。再置于３７℃温箱中培养３～４ｈ，观察记录结果。以药敏纸片周围无色区域为抑菌圈，根据抑菌圈直径大小判断细菌对抗菌药的敏感性。
１％ＴＴＣ溶液：称取０．１ｇＴＴＣ，溶于１０ｍＬ
灭菌蒸馏水中，装入褐色瓶内于７℃冰箱保存。
注意：ＴＴＣ不能存放太久，如遇溶液变色，则不能再用。
收稿日期：２００７－０７－１７
２．３结果判定
按照常规药敏片扩散法标准进行判读。判定
标准见表１。
－
２００７年第
２９卷第１６期ＣｈｉｎａＰｏｕｌｔｒｙＶｏｌ．２９，Ｎｏ．１６．２００７
经验交流
表１
抑菌圈直径（ｍｍ）
常规药敏片扩散法标准
敏感性极敏高敏中敏低敏
上进行的，没有颜色变化，只有细菌在琼脂表面集中生长形成菌苔后，肉眼才能观察明显，故需时间较长，一般为１６ｈ以上。而ＴＴＣ显色琼脂药敏法是在显色培养基上进行的，只要有细菌生长，培养基中的ＴＴＣ指示剂就由无色变成红色，因此形成肉眼可见抑菌圈所需的时间短，绝大多数菌株在
＞２０２０１５～１０～１４＜１０
３应用
２００６年５月～２００７年６月，笔者曾对驻马店
各养殖场临床检出的１７６株细菌同时用ＴＴＣ显色琼脂药敏法和常规药敏片扩散法进行药物敏感试验，并且用这两种药敏方法对标准菌株进行２０次检测。结果１６９株细菌用ＴＴＣ显色琼脂药敏法在４ｈ内获得结果，占９６．０％，与常规药敏片法敏感度完全相同或基本相同的有１６８株，占９５．４％。对标准菌株进行的药敏试验，两种方法取得的抑菌圈直径没有显著性差异。
４ｈ内可获得结果，且抑菌圈呈圆形无色，细菌生
长部分为鲜红色至紫红色，对比强烈，结果极易观察和判断。通过对比实验得出，ＴＴＣ显色琼脂药敏法药物敏感度和常规药敏片扩散法基本一致，而且选用标准菌株时抑菌圈二者没有显著差异，因此结果可靠，同时操作简单，无须增添特殊设简便、容易判读的特点，作为一种快备，具有快速、
速的药敏试验方法，可帮助临床兽医和畜禽养殖者及时选用有效抗菌药治疗畜禽疾病，特别适合各养殖场和基层兽医站推广使用。
４讨论
由于常规药敏片扩散法是在普通琼脂培养基
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（上接第４０页）
表１
日
龄
３］
用［１～，活化免疫器官，提高Ｔ、Ｂ淋巴细胞功能，单核
巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的吞噬能力，促进抗体生
单核细胞、嗜酸性粒细胞吞噬指数
组
别
单核细胞
嗜酸性粒细胞
成等多种功效，尤其是多糖的免疫活性最为突出，它可从多个层面发挥免疫增强作用，既可增强机体的特异性免疫，又可增强机体的非特异性免疫；既可增强正常机体的免疫功能，又可调节机体异常的
６］免疫功能［４～。寻找高效安全的免疫增效剂，是近年
２２
１％
０．５％
对照
３２
１％０．５％
对照
４２
１％０．５％
对照
５２
１％０．５％
对照
６２
１％０．５％
对照
１．９７１．９０１．７９２．８１２．７１２．６０３．４３３．３３３．１５３．５１３．４２３．２７３．４８３．３９３．２９１．８３１．７７１．６９２．２３２．２５２．１０３．１７３．１０２．９０３．４４３．２３３．０８３．４１３．３０３．１７
来医学和生物学领域研究的一个重要课题。中草药作为绿色天然植物，相对于化药免疫增强剂而言，无毒副作用，无残留污染。因此，中草药免疫增效剂将是今后畜禽免疫增效剂研究的趋势。
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１
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３．２关于中药“疫佳灵”的有效成分
黄芪、党参、白花蛇舌草等含有黄酮、多糖、皂
５１－５４．６
贾泰元，ＢｅｎｊａｍｉｎＨ．Ｓ．Ｌａｕ．党参对鼠Ｊ７７４巨噬细胞吞噬活性的
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