螺旋霉素产生菌抗噬菌体菌株的选育
Vol.23No.51997210
华 东 理 工 大 学 学 报
JournalofEastChinaUniversityofScienceandTechnology
・545・
螺旋霉素产生菌抗噬菌体菌株的选育
叶蕊芳3 郑 黎 谢志梅 杨 漓 唐光燕(华东理工大学生物工程系,上海200237)
提要:用Co60处理螺旋霉素产生菌PS,获得了一株抗噬菌体且摇瓶发酵单位比原菌株稍高的突变株R10,继而对R10进行理性化筛选,在加有22脱氧葡萄糖的分离培养基上分离到一株抗噬菌体稳定、摇瓶发酵单位又比R10高20%的新突变株,且其摇瓶发酵周期缩短12h、能耐受更高浓度的自身代谢产物——螺旋霉素。
关键词:螺旋霉素;螺旋霉素产生菌;噬菌体;抗噬菌体菌株;菌种选育中图分类号:TQ920
螺旋霉素是十六元环大环内酯类抗生素,体内的抗菌作用较强,具持续的抗生素后效应,能提高吞噬细胞的吞噬作用,且在体内分布广泛、组织细胞内浓度高,而不良反应却明显低于红霉素[1],对青霉素耐药的致病菌也具有较好的疗效[2],故在临床上有广泛的应用价值。
目前,国内一些螺旋霉素生产厂先后遭到噬菌体的侵染,给生产带来一定的影响。噬菌体的危害,虽然可采用改善环境条件和化学防治等方法加以控制,但较为有效的办法,还是采用选育抗噬菌体菌株的方法[3]。抗噬菌体菌株筛选工艺目前一般是以噬菌体作为筛子,采用各种诱变因子处理敏感菌株,筛选出生产能力不低于原菌株的具有抗噬菌体能力的新菌株。本文主要报导抗噬菌体菌株的研究情况。
1 材料与方法
1.1 菌株
螺旋霉素产生菌(Streptomycesspiramyceticus,PS),河南省华中医药集团提供。生物鉴定菌为八叠球菌(Sarcinalutea),本实验室提供。1.2 原料
淀粉、葡萄糖、豆饼粉、鱼粉、玉米浆,工业用,华中医药集团公司提供;CaCO3,轻质,华中医药集团公司提供;MgSO4・7H2O、NaCl、NH4NO3、KH2PO4、K2HPO4、NaNO3、KCl、甘油,化学纯;蛋白胨、牛肉膏、琼脂,生化试剂。FeSO4・7H2O、
1.3 培养基主要成分及培养条件
斜面培养基:葡萄糖、豆饼粉、琼脂。MgSO4・7H2O、CaCO3、分离培养基:同上。
种子培养基:淀粉、豆饼粉、葡萄糖、NaCl。
收稿日期:1996210223
发酵培养基:淀粉、葡萄糖、鱼粉、玉米浆、NH4NO3、NaCl、MgSO4・7H2O、CaCO3、KH2PO4。
噬菌体试验用培养基。
制备裂解液用培养基:蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、NaCl。测定噬菌体效价用培养基:底层为NaNO3、K2HPO4、MgSO4・7H2O、KCl、FeSO4・7H2O、甘油、琼脂1.5%。上层为琼脂1.2%,其它同上。
孢子接入斜面培养基后,28°C培养10d左右,孢子成熟后4°C冰箱保存备用。斜面孢子接入种子培养基后于230r min旋转式摇床培养48h左右,以8%接种量接入发酵瓶,于旋转式摇床培养96h(种子及发酵的培养温度均为(28±1)°C然后采用生物鉴定测定效价。
1.4 噬菌体的分离和纯化及噬菌体裂解液的制备
将不正常发酵液离心,取上清液经蔡氏过滤器过滤,取滤液稀释后以双层琼脂平板法分离得空斑,用针刺法挑取单个空斑连续进行3次单空斑分离纯化。噬菌体裂解液的制备见文献[4]。
1.5 抗噬菌体菌株的选育
直接法:出发菌株经各种诱变因子处理后,直接涂布在含有噬菌体的斜面或平板上,28°C培养10d左右,待长出菌落后再进行复证。
间接法:a)出发菌株经各种诱变因子处理后,接入种子培养基,同时加入噬菌体裂解液,28°C旋转式摇床培养,待再生菌丝长出后用玻璃珠打碎,取此液涂布在含有噬菌体的分离培养基上,28°C培养10d左右,待长出菌落后再进行复证。b)出发菌株经各种诱变因子处理后,先接种在斜面培养基上,待孢子长得比较丰满后再制成单孢子悬液,取此液涂布在含有噬菌体的分离培养基上,28°C培养10d左右,待长出菌落后再进行复证。1.6 抗性菌株稳定性试验及发酵摇瓶试验
上述得到的抗性菌落,多次重复进行抗性稳定性试验,即将初次得到的抗性菌株用逐个挑取法点种在含有噬菌体的分离培养基上,同时用敏感的出发菌株作对照。获得稳定抗性的菌株进行摇瓶试验,选取发酵单位高的抗性菌株。1.7 抗性菌株的溶原性试验
在上述反复进行抗性试验的基础上,最后选择发酵单位高的菌株用紫外线诱导[5]进行初步的溶原性试验。
第一组:接入抗性菌株;
第二组:接入抗性菌株,同时加入1mL噬菌体裂解液(1011个 L);第三组:接入抗性菌株和敏感菌株PS;
第四组:接入经紫外线10s处理的抗性菌株和敏感菌株PS;
第五组:接入敏感菌株PS,同时加入1mL噬菌体裂解液(1011个 L)。上述5组摇瓶于28°C振荡培养2d,测定噬菌体的效价,共重复3次。
2 结果和讨论
2.1 噬菌体的分离和纯化
在不正常发酵液中分离到的噬菌体,经3次纯化得到空斑大小较一致的噬菌体,其空斑较大,呈圆型,边缘光滑清晰透明,见图1。
2.2 抗噬菌体菌株的选育
60
经紫外线、紫外线及氯化锂复合处理等多因素诱变,结Co、
果见表1。
抗性菌株均是由Co60经间接法获得的。这可能是因为该菌株
图1 平板上的噬菌斑对Co60较为敏感,刚处理后的孢子悬浮液中抗性突变的孢子数目
很少,直接筛选难以得到。而处理后的孢子液经培养增殖后,抗性变异的数目相对增加,这样就增加了获得抗性菌株的机率。
获得的20株抗性菌株经噬菌体进一步筛选,淘汰了8株不稳定菌株,12株稳定的抗性突变株,经发酵摇瓶试验,其中有5株接近或超过了出发菌株的发酵水平,结果见表2。
表1 各种诱变剂处理结果比较
出发菌株
诱变因素紫外线
剂量
60s75s
死亡率(%)
91.096.489.795.457.076.096.099.5
获得抗性菌株数
000026012
紫外线+氯化锂(w=0.005)
PS
60s75s700Gy
Co601000Gy1500Gy2000Gy
表2 发酵摇瓶试验结果3
菌株号
PSR1R2R34
相对效价(%)
[1**********]
菌株号
R5R6R7R89
相对效价(%)
[1**********]
菌株号
R10R11R12
相对效价(%)
12000
3出发菌株PS的相对效价为100%
2.3 溶原性试验
取发酵单位较高的R10经紫外线诱导进行溶原性试验,结果见表3。
表3 溶原性试验结果
编号第一组第二组第三组第四组第五组(对照组)
实验内容3试验菌R10
试验菌R10和噬菌体(1011个 L)1mL试验菌R10和敏感菌PS
试验菌R10经紫外线诱导10s和敏感菌PS敏感菌PS和噬菌体(1011个 L)1噬菌斑数 个・L-无
1010
1
无
无
1013
3该试验在装量为25mL培养基的250mL的摇瓶中进行。
第一组无噬菌体出现,说明试验菌未带有噬菌体;第二组加入的噬菌体基本上没有增殖,(因按稀释率计算,噬菌斑应为1011 26=3.85×109 L)。而在对照的第五组中加入的噬菌体则明显增加,说明试验菌可属抗性菌株;第三组无噬菌体出现、第四组经诱导后仍未见有噬菌体出现,说明该试验菌既不自发释放噬菌体、在诱导情况下也不释放噬菌体。综上所述:1.该试验菌株是抗性菌株;2.该试验菌未带有噬菌体;3.该试验菌株是非溶原性的。2.4 抗性菌株R10的诱变育种
鉴于抗性菌株R10摇瓶发酵单位与敏感菌株PS相比提高幅度不大,我们采用物理、化学因素多次对R10菌株进行理性化筛选,即将处理过的孢子悬浮液涂布在含有22脱氧葡萄糖的平板上,获得一株摇瓶发酵单位比R10菌株提高20%的新菌株T28。2.5 抗自身代谢产物螺旋霉素的性能比较
将PS菌株和T28菌株的斜面孢子分别接种在含有不同螺旋霉素浓度的分离培养基上培养,并观察其菌落生长情况,结果见表4。
表4 PS菌株和T28菌株对螺旋霉素耐受性的比较 结果表明:发酵效价高的菌株对自身
代谢产物的抗性也高。这是因为大多数抗螺旋霉素浓度 u・mL-1
菌株生素的生物合成都受到终产物本身对其生
1500+++++
2000-++
2500-+
3000--PST28
+++:生长很好,++:生长良好,+:生长,-:不生长
物合成过程的反馈抑制[6],一定浓度的螺
旋霉素会引起产生菌终产物的抑制或阻遏作用,而生产能力与耐受抗生素本身的能力之间有相关性,即高单位的菌株耐受抗生素的能力往往比低单位菌株强。
2.6 抗性菌株T-8摇瓶发酵初探
将T28菌株进行二级摇瓶发酵试验,周期分别为72h,84h和96h,结果见表5。
表5 T28菌株摇瓶发酵试验结果 结果表明:突变株的发酵周期有所缩短。这发酵周期 728496h可能与其代谢特性的改变有关,我们将在以后
390120100相对效价(%)
详细研究。
3相对效价以96h为100%
致谢:本课题由河南省华中医药集团提供赞助,特此致谢。
参考文献
1 朱 峰,王尔健.螺旋霉素的再评价.中国抗生素杂志,1991,16(3):231～235
2 LeoCVining.BiochemistryandGeneticRegulationofCommerciallyImportantAntibiotics.Canada:Addison2Wesley
PublishingCompany,1983,179
3 武汉大学,复旦大学.微生物学.第2版.北京:高等教育出版社,1987,157
4 唐光燕,邢昌年,钦葆纯等.洁霉素产生菌抗噬菌体菌株的选育.抗生素,1979,(1):9～13
5 杜 艳,陈孝康,周健明等.螺旋链霉菌溶源性菌株的确证及生物学特性.中国抗生素杂志,1991,16(3):169～1746 李友荣,马辉文.发酵生理学.长沙:湖南科学出版社,1989,214～222
ScreeningofStreptomycesSpiramyceticus
forPhage-ResistantStrain
YeRuifang,ZhengLi,XieZhimei,YangLiandTangGuangyan
3
(DepartmentofBiochemistryEngineeringECUST,Shanghai200237)
Abstract:Ahighspiramycin2yieldingandphage2resistingmutantwasobtainedbywayof
.ThestartingstrainStreptomycinspiramyceticusPSwasfirsttreatedwithCoir2mutagenesis
radiation,thephage2resistingmutantR10isolatedwithaslightlyhigheryield.ThenfromstrainR10throughrationalscreening,thestrainT28wasisolatedonaplatingmedium,con2taining22deoxyglucose.T28hasthestablephage2resistingfeaturewitha20%increaseinyieldand12hshorteninginfermentationtimewhencultivatedinshakingflaskascomparedwithR10.
Keywords:streptomycin;Streptomycinspiramyceticus;phage;phage2resistantstrain;screening(上接第539页)
CharacteristicsinBiotransformationProcess
withFreeE.coliCells
ZhouChanglin,QiuWeiran,ZhouLiandYuJuntang
3
(StateKeyLaboratoryofBioreactorEngineeringECUST,Shanghai200237)Abstract:Thecalculationmethodoftheoreticalsubstrateconversionrateintheenzyma2ticpreparationofnucleosidepharmaceuticalscatalyzedbyphosphorylasefromfreeE.colicellswasstudied.Inaddition,Itwasshownthatphosphorylaseactivityoffreecellswas.IfwetE.colicellswerecloselyrelatedtotheircultureconditionandpretreatmentprocedures
～3days,thestabilityofphosphorylasewithincellswasincreased,theinhibi2driedat4°C2tionwithincellsreducedandthesubstrateconversionrateincreasedby33.5%.
Keywords:nucleosidepharmaceuticals;enzymaticsynthesis;phosphorylase;E.coli