中药材抗氧化及自由基清除活性的研究_刘方

・中药及天然药物・

中药材抗氧化及自由基清除活性的研究

刘方1,武子斌2,牛淑敏1,何锦姝1,邢来君1(1.南开大学生命科学学院,天津300071;2.香港中文大学生物化学系)

摘要:目的　探索10种待测药材提取物是否具有抗氧化和自由基清除活性。方法　分别采用红细胞溶血、脑匀浆脂质过氧化和DNA损伤抑制的生物测定法,以及对化学反应产生自由基抑制的化学测定法。结果　在10种待测药材中,白芍、白菊花、杜仲、千里光、丹皮和淫羊霍具有明显的抗氧化和自由基清除活性,其不良反应小。结论　药材中含有高的抗氧化和自由基清除成分。因此,有进一步探讨的价值。关键词:药材;抗氧化;自由基

中图分类号:R284　文献标识码:A　文章编号:1001-2494(2001)07-0442-04

StudiesonantioxidativeandfreeradicalscavengingactivitiesofChineseherbs

LIUFang1,WUZi2bin2,NIUShu2min1,HEJin2shu1,XINGLai2jun1(1.CollegeofLifeSciences,NankaiUniversity,Tianjin

300071,China;2.theChineseUniversityofHongKong,HongKong,China)

ABSTRACT:OBJECTIVE　Toinvestigatethatwhethertheextractsoftentestedradicalscavengingactiv2ities.METHODS　BiologicalassayswereusedtodeterminethehemofbrainhemogenatesandDNAdamage.ChemicalassayswereusedtotheRESULTS　PaeonialactifloraPall.Chrysanthemum2Ham,PaeoniasuffruticosaAndr.andEpimediumsagit2tatum(Sieb.etZucc.)amongstronglyantioxidativeandfreeradicalscavengingactivitiesandlowside2effects.CON2

CLUSION　Therewereandfreeradicalscavengingcomponentsinseveralherbs.Therefore,itisworthytoresearchfurther.KEY　WORDS:herb;antioxidant;freeradical

　　日光、紫外线、电离辐射、化学反应以及机体代谢过程所产生的活性氧具有广泛的病理学效应,例如,DNA损伤、致癌作用以及与衰老有关的一系列问题[1]。最近的一些研究发现,在人类免疫缺陷病毒(HIV)感染人群体内,由于抗氧剂消耗量的上升,进而导致了体内抗氧化剂的缺乏。因此推测提高抗氧化剂的摄入量,可延迟HIV感染者爱滋病病发的时间[2]。我国有丰富的植物资源,植物中酚类、黄酮类、萜类和多种提取的抗氧化活性的研究越来越受到关注[3～4],并且在衰老的自由基学说以及与衰老相关的疾病研究中,抗氧化活性物质的研究也占有很重要的地位[5～6]。国家自然科学基金一直积极资助植物中抗氧化活性成分研究的课题,而且,绿茶的抗氧化作用已被充分肯定[7～9]。因此,从药材中筛选具有抗氧化和自由基清除活性的物质,既具有理论意义,又具有应用价值。1　材料和方法1.1　材料

1.1.1　试剂　DNA(Ⅰ型,小牛胸腺)、硫酸博来霉

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素、丁化羟基苯甲醚(BHA)、维生素C均购自Sigma

公司。2,2′2偶氮2双2(22脒基丙烷)氯化二氢(AAPH)购自Wak公司。其它试剂为分析纯。

1.1.2　动物　本研究采用♂Sprague2Dawley大鼠(150～200g),在实验室条件[(21±2)℃,12/12h昼夜循环]下,用标准啮齿类食物饲养。1.1.3　植物水提取物的制备　本研究采用的药材均购自香港九龙药店,包括七叶一枝花(Parischi2nensisFranch.)、白芍(PaeonialactifloraPall.)、白菊花(ChrysanthemummorifoliumRamat.)、白术(Atracty2lodesmacrocephalaKoidz.)、杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)、千里光(SenecioscandensBuch2Ham)、当归(Angelicasinensis(Oliv.)Diels.)、丹皮(Paeoniasuf2fruticosaAndr.)、淫羊霍[Epimediumsagittatum(Sieb.

etZucc.)Maxim]和桃仁[Prunuspersica

(L.)

Batsch.]。鉴定由本单位植物研究室进行[10]。干燥

的药材切成小块,室温下用水浸泡过夜,回流煮沸2

基金项目:国家自然科学基金资助项目(39970023)

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h,将水提取物倾出,5000r・min-1离心10min,将上

清液冷冻干燥,所得干粉用于本研究。1.2　方法

1.2.1　体外大鼠脑匀浆脂质过氧化作用的测定　

测样品体系的吸光值。②羟自由基清除活性的测

定[12]:在维生素C2CuSO4体系中,Cu2+还原产生羟自由基,再根据羟自由基氧化细胞色素C(CytC)的颜色反应进行测定。本研究采用3mL磷酸钠盐缓冲液(0.15mmol・L-1,pH7.4)的羟自由基产生体系,其中含100μmol・L-1维生素C,100μmol・L-1CuSO4,12μmol・L-1CytC,以及不同浓度的待测样品。此体

取正常大鼠的脑,剪成小块后,用Polytron电动匀浆

器,在冰冻Tris2HCl缓冲液(20mmol・L-1,pH7.4)中,得到1/10匀浆。所得匀浆以14000r・min-1离心15min,将匀浆中的上清均分成1mL加到含有待测样品、10μmol・L-1FeSO4和0.1mmol・L-1维生素C的试管中,于37℃保温1h。保温结束后,加入1.0mL三氯醋酸(TCA,28%)终止反应,再加入1.5mL硫化巴比妥酸(TBA,1%),然后将此体系于100℃加热15min。离心除去蛋白质沉淀后,于532nm测定丙二醛(MDA)2TBA复合物的吸光度[11]。BHA(丁化羟基苯甲醚)作为阳性对照。待测样品的抗氧化活性以下式计算:抑制率(%)=(A-A1)/A×100%。其中A为对照的吸光度,A1含待测样品体系的吸光度。

1.2.2　红细胞溶血的测定　针刺大鼠心脏采血,并

系于25℃保温90min后,在550nm测定CytC的透光率的变化。硫脲作为阳性对照,并将其抑制率视

为100%。羟自由基清除活性以下式表示:抑制率(%)=

×100%。

T-T1

)产生体系的透光值,T1为其中T为羟自由基(OH・

)的透光值,T2为含待测样品体系对照体系(无OH・

的透光值。

1.2.4　博来霉素造成DNA损伤的测定　按Aeschlach等[13]。0.5mL的反

0.5mgL-05mg・mL-1硫酸mm1mmol・L-1FeCl3,以C作为阳性对照。

37℃保温1h,以0.05mLEDTA(0.1mol・L-1)终止反应。再加入0.5mLTBA(1%)和0.5mLHCl(25%)进行显色反应,80℃保温10min。离

收集于含肝素的试管。分离红细胞,用0.15mol・L-1NaCl,胞于2500r・min-。

此分析体系采氧自由基造成红细胞溶血[11]。以pH7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)制备10%的红细胞悬液。在1mL的红细胞悬液和待测样品中,加入等体积的200mmol・L-1AAPH(溶于PBS)。于37℃恒温水浴振荡2h。然后将此体系以8倍体积的PBS稀释,2500r・min-1离心10min,于540nm测定上清液的吸光值A。同样,将此体系以8倍体积的蒸馏水稀释,以达到红细胞完全溶血,并在540nm测定上清的吸光值B。维生素C作为阳性对照。抑制溶血百分率按下式计算:抑制率(%)=(1-A/B)×100%。1.2.3　自由基清除活性的测定　①超氧阴离子清除活性的测定[12]:在吩嗪硫酸甲酯(PMS)2NADH(还)体系中,NADH氧化产生超氧阴离子,原型辅酶Ⅰ

超氧阴离子可还原氮蓝四唑(NBT)为蓝色产物。本研究采用3mLTris2HCl缓冲液(16mmol・L-1,pH

mol・L-18.0)的超氧阴离子产生体系,其中含78μ

NADH,50μmol・L-1NBT,10μmol・L-1PMS,以及不同浓度的待测样品。在560nm测定超氧阴离子与NBT的颜色反应。维生素C作为阳性对照。超氧阴离子清除活性以下式表示:抑制率(%)=(A-A1)/A×100%。其中A为对照体系的吸光值,A1为含待

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心后,以532nm测定吸光值的增加来表示DNA的损伤程度。

2　结　果

在研究的10种植物中,白芍、白菊花、杜仲、千里光、丹皮和淫羊霍能够有效抑制大鼠红细胞溶血(表1)。除杜仲外,其余5种植物均能抑制大鼠脑匀浆脂质过氧化作用(表2)。白芍、白菊花、杜仲、千里光、丹皮和淫羊霍均具有很高的超氧阴离子(表3)和羟自由基(表4)清除活性。尽管七叶一枝花和

桃仁在生物测定系统中,既没有抑制大鼠红细胞溶血的作用,也没有抑制大鼠脑匀浆脂质过氧化作用(表1,2),但它们均具有清除超氧阴离子(表3)和羟自由基(表4)的活性。在DNA损伤实验中,七叶一枝花、白术、当归、丹皮和桃仁几乎无任何促氧化效应(表5)。白芍、白菊花、杜仲、千里光和淫羊霍仅有较小的促氧化效应,其促氧化效应低于维生素C的4～7倍。3　讨　论

从结果分析中可以看到,不同的测定方法,白芍、白菊花、千里光、丹皮和淫羊霍的结果基本一致;杜仲只有抑制大鼠红细胞溶血的作用,而无抑制大

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表1　药材提取物对大鼠红细胞溶血的影响.n=3,