双向电泳2D技术
双 向 电 泳 技 术
沈万赟
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1/ GE Title or job number / 9/10/2012
Life Sciences 的历史
LKB ——电泳发明者
Pharmacia ——层析技术开创者 Amersham Biosciences ——提供基因组、蛋白组学研究整体解决方案
GE Healthcare Life Sciences
——实现从发现到功能研究，从体外到体内的突破
GE Healthcare milestones in 2-D electrophoresis
Amersham Biosciences launched Ettan DIGE
2002
2000
2000 1998 1993 1991 1982 1979 1978
Amersham Pharmacia Biotech launched Typhoon
Pharmacia Biotech launched DALT II system
Pharmacia Biotech introduced IPGphor
Pharmacia Biotech introduced ImageMaster suite
Pharmacia Biotech introduced Immobiline DryStrip
LKB introduced Immobiline
Pharmacia Fine Chemicals introduced Pharmalyte
The first multiple separation system, ISO-DALT, was developed
1973
1967
The Multiphor flatbed electrophoresis unit is launched. In production for 30 years in 2003!
LKB introduced Ampholine, the first commercial carrier ampholyte
3/ GE Title or job number / 9/10/2012
Proteomics
一个细胞在特定生理或病理状态下表达的所有种类的蛋白质称 为蛋白质组(proteome) 仅仅从基因组学水平上无法彻底的了解各种生命现象, 因为蛋 白质才是生命活动的真正执行者 从基因组学上我们无法检测到转录后修饰、翻译调节、选择性 剪切、以及蛋白复合物形成、蛋白质相互作用等生命现象; 此 外并不是细胞内的所有的DNA都翻译转录成蛋白质
4/ GE Title or job number / 9/10/2012
Proteome Analysis and Proteomics
pH逐渐增加的pH梯度，处在其中的蛋白分子在电场的作用下运 动，最后各自停留在其等电点的位置上，测出蛋白分子聚焦位置的pH值， 便可以得到它的等电点。
11 / GE Title or job number / 9/10/2012
增高的pH梯度
5.1
6.4
8.6
阳 极
阴 极
PI=5.1
PI=6.4
PI=8.6
16 Presenter and Event 9/10/2012
固相 pH梯度 (IPG)
固相凝胶
(支持膜上0.5 mm 厚凝胶)
丙烯酰胺缓冲液: Immobiline CH2=CH-CO-NH-R, R ：羧基或叔胺基
18 / GE Title or job number / 9/10/2012
第二向：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)原理
在聚丙烯酰胺凝胶电泳系统中加 入一定量的十二烷基磺酸钠（SDS） ，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取 决于蛋白质的分子量大小。
C A T H O D E _ _ _ _ _ _ _
_ _ _ _ _ _ __
SDS：蛋白 = 1.4：1
_
__
_
_ __ _ _
_ _
_ _ _ _
Sodium Dodecyl Sulfate(SDS)
_ _ _
__ _
+ + + + + + +
19 Presenter and Event 9/10/2012
A N O D E
Why 2D?
酵母细胞表达6,216种蛋白
1000
至今1,484个蛋白被鉴定 (Nat.Biotechnol. 17,676 and 19, 242)
2DE 工作范围
100
Mr [kDa]
10
注: 图片中没有特别强调蛋白丰度和疏水性
From: Wildgruber et al. Electrophoresis 21 (2000) 2610-2616.
1 2 4 6 8 10 12 14
pI (理论值)
21 / GE Title or job number / 9/10/2012
Why 2D?
• 对未处理样本耐受性好
不需要预纯化 (如：色谱层析)
• 分辨率非常高 • 2D 是有效的组分收集器 • 蛋白在凝胶介质中受到保护
• 在蛋白质组学技术中应用范围最广（front-end ）
• 直到目前为止唯一可以同时检测上千种蛋白的技术 • 与后续分析技术兼容性好 (质谱分析)
22 / GE Title or job number / 9/10/2012
寻找差异蛋白质
细 胞
环孢素A处理前 环孢素A处理后
组 织
正常 组织 肿瘤组织
23 / GE Title or job number / 9/10/2012
双向电泳工作流程
SDS-PAGE
样品制备
等电聚焦
图像获取
基于凝胶的工作流程
图像分析
自动点靶
蛋白质斑点切取
自动酶解
25 / GE Title or job number / 9/10/2012
2D/MS 经典工作流程
细胞
蛋白标记
组织
差异分析 挖点 酶解 点靶
微生物
样品制备
分离
染色
图谱分析
植物
体液
细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量
双向电泳 第一向 第二向
银染 考染 荧光
图像获取 图谱分析
蛋白鉴定
26 / GE Title or job number / 9/10/2012
样品制备一般原则
• 制备流程简单 • 减少样品降解 • 新鲜制备 • 除去颗粒物 • 不要采用加热的方法
28 / GE Title or job number / 9/10/2012
2D/MS 经典工作流程
细胞
蛋白标记
组织
差异分析 挖点 酶解 点靶
微生物
样品制备
Separation
染色
图谱分析
植物
体液
细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量
双向电泳 第一向 第二向
银染 考染 荧光
图像获取 图谱分析
蛋白鉴定
29 / GE Title or job number / 9/10/201
2
提高电压
IPGphor II：8000V
IPGphor III： 10000V
32 / GE Title or job number / 9/10/2012
Immobiline 干胶条的特性
• 可重复性 • 无梯度漂移, 真正的平衡方法 • 可分离酸性和碱性蛋白 • 容纳蛋白样本量更多 • 水平和垂直 SDS 凝胶中都能使用 • 允许样本水化上样 • 机械强度和尺寸稳定
• 易操作
• 易于对样本跟踪标记
33 / GE Title or job number / 9/10/2012
不同pH范围胶条
• 不同长度、多种窄pH范围胶条可选，尤其是1个pH范围 • pH7-11NL碱性胶条
34 / GE Title or job number / 9/10/2012
宽pH 、窄 pH 范围胶条
pH 3 4 5 6 7 8 9 10
宽pH梯度胶条应用: 整个蛋白图谱 窄 pH梯度胶条应用: 提高分辨率 增加样品上样量 检测分析更多蛋白
4
5
6
7
8
9
36 / GE Title or job number / 9/10/2012
提高分辨率: 斑点显现
Mouse liver proteins
IPG 4-7
IPG 4-7
IPG 5-6
IPG 5.5-6.7
From A. Görg et al. (1999)
37 / GE Title or job number / 9/10/2012
不同长度的胶条
7 cm 11 cm 13 cm 18 cm 24cm
38 / GE Title or job number / 9/10/2012
线形与非线形胶条
linear (L)
nonlinear (NL)
for most samples
for samples with abundant proteins in the range between pH 5 and 7 Serum proteins
39 / GE Title or job number / 9/10/2012
Cell lysates Tissue extracts
pH 3-10 L and NL
Tissue Proteins from Mouse Liver
linear (L)
nonlinear (NL)
from Prof. Angelika Görg, Technical University Munich
40 / GE Title or job number / 9/10/2012
泡涨盘 VS 聚焦盘
41 / GE Title or job number / 9/10/2012
IPG 水化上样
44 / GE Title or job number / 9/10/2012
杯上样 & 纸桥上样
杯上样：
有些情况下，需要在水化之后加样，然 后立即进行IEF 电泳，例如，如果担心 发生蛋白质水解或其他蛋白质修饰，样 本经过过夜的水化过程就不合适了。 使用碱性Immobiline DryStrip 凝胶时， 阳极样本杯上样可改善双向电泳斑点图 像。
纸桥上样：
纸桥上样适合于非常大量的样本和制备 电泳，特别是采用碱性pH 范围时。
46 / GE Title or job number / 9/10/2012
IEF电泳
IPGphor 包括半导体温控系 统(20°C)和程序化电源 (10000V) 可同时进行12根胶条的等电 聚焦 聚焦效果以“Vh”数控制， 可提高重复性
47 / GE Title or job number / 9/10/2012
IEF电泳
设置IPGphor 仪器运行参数： 1、水化：电压，温度和时间； 2、等电聚焦电泳：梯度电压和温度，完成 Vh
1. 30v 2. 100 V 3. 1000 V 4. 8000 V 5. 8000 V
Step Step Gra Gra Step
12hr 1.0hr 1.0hr 2.0hr 42000vhr
48 / GE Title or job number / 9/10/2012
IPG 胶条的平衡——两步平衡
• SDS 电泳前, 平衡母液: 2% SDS, 50mM Tris-HCl pH 8.8, 6M urea, 30% glycerol + 蛋白与SDS结合 甘油和尿素降低电内渗作用 • 第一步DTT平衡：使变性的非烷基化蛋白处于还原状态 (1 x 15min) 1% DTT • 第二步碘乙酰胺平衡：去除多余的 DTT
，防止拖尾 (1 x 15min) 2.5% iodoacetamide
49 / GE Title or job number / 9/10/2012
第二向垂直电泳系统
放置 IPG strip
低熔点琼脂糖
琼脂糖覆盖密封
50 / GE Title or job number / 9/10/2012
Push the IPG Strip Down onto the Gel Surface
51 / GE Title or job number / 9/10/2012
Seal the Cassette and Fix the IPG Strip with Agarose
52 / GE Title or job number / 9/10/2012
Inserting the Cassette
53 / GE Title or job number / 9/10/2012
SDS-PAGE 参数
54 / GE Title or job number / 9/10/2012
SE-600 Ruby
55 / GE Title or job number / 9/10/2012
Ettan DALTsix
56 / GE Title or job number / 9/10/2012
第二向系统
strip length (cm) gel size (cm) number running of gels time (hr)
Ettan Dalt12
Ettan Dalt6 SE 600 MiniVE Multiphor II
18, 24
18, 24 2 x 7, 13 7 7, 11 18
25 x 20
25 x 20 14 x 16 (24) 8 x 7, 8 x10 24 x 11* 24 x 18 4x4
12
6 4 2 1 1 2
4.5
4.5 4 1.5 1.5 3.3 0.5
PhastSystem
(4)**
* 2 or 3 strips side-by-side ** cut or home-made strip
58 / GE Title or job number / 9/10/2012
2D/MS 经典工作流程
细胞
蛋白标记
组织
差异分析 挖点 酶解 点靶
微生物
样品制备
分离
染色
图谱分析
植物
体液
细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量
双向电泳 第一向 第二向
银染 考染 荧光
图像获取 图谱分析
蛋白鉴定
59 / GE Title or job number / 9/10/2012
Protein Detection Methods
Sensitivity limit 100 ng 15 ng 200 pg 400 pg 250 pg Quantitation +++ + + ++++ ++++ Living cells no no no no no Linear Dynamic Range 3 3 7 104 104
Coomassie Blue staining Negative staining Silver staining Fluorescent staining Fluorescent labelling Radioactive labeling: X-ray film Phospor-imager plates Stable isotope labelling
1 pg 0.2 pg
+++ ++++ ++++ (with MS)
yes yes yes
20 105 ?
60 / GE Title or job number / 9/10/2012
Coomassie Blue-考马斯亮蓝染色
+ 灵敏度 ，低至0.01 mg (“胶体”考染)
+ 非特异性染色
+ 染料与蛋白成比例结合 + 线性化好
- 扩散速度受限，胶的厚度影响跑胶速度
- 纯度不够
- 有限的动力学范围
61 / GE Title or job number / 9/10/2012
胶体考马斯亮蓝染色
1 mg E. coli strain B
IPGphor 24 cm pH 4 - 7 Colloidal CBB G250 staining
62 / GE Title or job number / 9/10/2012
银染
+ 灵敏度 ，低至0.2 ng
+ 在凝胶基质中与蛋白交联 + 自动催化反应
- 染凝胶表面蛋白 - 线性化程度比考染低 -一些大分子物质也被染色 - 步骤多，某些步骤时间控制严格
63 / GE Title or job number / 9/10/2012
凝胶的染色及检测
硝酸银染色：
银染的方法种类有100多种。 大致原理：银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表 面上而显色。可染出胶上低于1 ng/蛋白质点。
64 / GE Title or job number / 9/10/2012
凝胶的染色及检测
银染注意事项： 1). 使用戊二醛（glutardialdehyde） 优点：提高银染的灵敏度和染色结果的重复性，
缺点：修饰蛋白质，影响质谱鉴定和分析； 2). 保证所有的染色器皿绝对的干净，可使用玻璃或塑料做染色器皿；
3). 至少要用双蒸水（导电率
4). 染色过程中避免手去接触凝胶，必须戴上一次性手套或无粉乳胶手套； 5). 所用的化学试剂一定是要分析纯（ AR ） 。
65 / GE Title or job number / 9/10/2012
Silver stained gel of E. coli Lysate
IPG 4-7
Silver stained with PlusOneKit without glutaraldehyde and formaldehyde in the Ag sol.
66 / GE Title or job number / 9/10/2012
2D/MS 经典工作流程
细胞
蛋白标记
组织
差异分析 挖点 酶解 点靶
微生物
样品制备
分离
染色
图谱分析
植物
体液
细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量
双向电泳 第一向 第二向
银染 考染 荧光
图像获取 图谱分析
蛋白鉴定
67 / GE Title or job number / 9/10/2012
ImageScanner III图像扫描系统
•灰度校正功能
•平台具有防水功能，可直接扫描SDSPAGE湿胶。
•3.7OD高动态范围，保证高、低丰度 蛋白的准确定量。
•扫描平台大，A3扫描面积，一次可扫 描2块24cm凝胶。
Gray 256 scale Transmissive 300dpi
68 / GE Title or job number / 9/10/2012
ImageMaster 2D双向电泳分析软件
• • • • • • 由SIB, GeneBio和GE Healthcare合作开 发，为SwissProt推荐分析软件。 高效能参数自动找点，全自动蛋白定量计 算方法，不受背景影响。 在原始数据上进行分析，结果可靠。界面 窗口可随意设计，界面极其友好。 全自动凝胶匹配，采用先进的算法。根据 点的相关因素、形状、位置、周围情况， 胶间匹配效率高。 多种统计学分析工具，快速找到胶间蛋白 表达差异。 可直接链接到ExPASy 和 SwissProt 数据库，进行网上检索。 全部操作过程都可以撤销/重作操作，每 一步骤都附有说明，使用方便。 全面支持DIGE技术，源自DeCyder 2D软 件。
69 / GE Title or job number / 9/10/2012
•
•
2D/MS 经典工作流程
细胞
蛋白标记
组织
差异分析
微生物
样品制备
分离
染色
图谱分析
挖胶
植物
体液
细胞裂解 匀浆 预分级 除杂质 浓缩 定量
双向电泳 第一向 第二向
银染 考染 荧光
图像获取 图谱分析
蛋白鉴定
71 / GE Title or job number / 9/10/2012
72 / GE Title or job number / 9/10/2012
自动斑点切取——Spot picker
切点针头
胶盘
73 / GE Title or job number / 9/10/2012
传统双向电泳面临的新要求
重复性 定量精确性 灵敏度
线性动态范围
质谱兼容与否
76 / GE Title or job number / 9/10/2012
检测诱导的生物学变化-我们实验的目
的
由于疾病状态，药物处理，生命周期而引起的 差异
实验的因素 IEF/SDS-PAGE电泳条件的偏差 凝胶失真 实验者的操作误
差 数据分析 操作者各自对数据的编辑和理解 在种群间固有的个体差异 例如动物与动物之间，植物与植物之间，或者培养 物和培养物之间，在同一条件下的差异 遗传性生物学差异 诱导的生物学变化 —--要检测的差异
系统偏差
(凝胶之间的差异)
DIGE可以有效的消除误差，找到真实的诱导生物学差 异
77 / GE Title or job number / 9/10/2012
内标的使用
IS A 1 2
胶 A
内标 (Cy2)
IS B
样品 1 (Cy3)
样品2(Cy5)
利用内标
3
4
胶 B
内标 (Cy2) 样品3 (Cy3) 样品4 (Cy5) 每块胶上都有相同的内标，在胶B中蛋白丰度的增加，通过内标的增加判断是胶与胶之 间的偏差。 79 /
GE Title or job number / 9/10/2012
2-D DIGE – 内标
什么是内标? 内标为实验中的每张胶上的每个蛋白质样本提供了一个参考点。理想情 况下，内标代表了一次实验中来源于所有样本的每一个蛋白质。最好的 办法就是等量混合所有的样本生成内标。
C1
C2
C3
T4
T5
T6
Pooled sample (internal standard)
80 / GE Title or job number / 9/10/2012
EttanTM DIGE 工作流程
81 / GE Title or job number / 9/10/2012
EttanTM DIGE 工作流程
混合内标样品 用 Cy2标记 Cy2
样品1 用Cy3标记
Cy3
样品2 用Cy5标记
Cy5 2D 分离
样品被分别 标记后混合
用Typhoon多 功能扫描成像 系统采集凝胶 图像
用DeCyder全自动差 异分析软件进行图像 分析和数据定量
82 / GE Title or job number / 9/10/2012
Thank you for your attention!