逆转录病毒载体携带目的基因防治增殖性玻璃体视网膜病变的实验探究

逆转录病毒载体携带目的基因防治增殖性玻

璃体视网膜病变的实验研究

同济医科大学附属协和医院眼科

博士研究生

导万光明师曾水清教授

摘要

增殖性玻璃体视网膜病变（ＰＶＲ）是视网膜脱离或眼外伤后的一种严重并发症，常导致严重的视力损害，因玻璃体切除手术不能防止其复发，且药物防治ＰＶＲ方面的研究不尽人意，所以寻求防治ＰＶＲ的新途径势在必行。／基因治疗与传统的治疗方法有着根本的不

＼

同，它是指应用现代基因工程技术，将外源目的基因导入靶细胞，并使其表达，达到预防或治疗某种疾病的目的。有人曾用逆转录病毒载体携带自杀基因的方法，观察其在体外及眼内对成纤维细胞增殖的影响，取得了较好的效果。但在增殖膜已初龙，琶成的ＰＶＲ模型／～

眼内进行基因转染以治疗ＰＶＲ，目前尚未见报导Ｊ本实验在制作ＰＶＲ

／

模型后，实验一用逆转录病毒载体携带报告基因注入ＰＶＲ模型眼内，证实了这种方法对ＰＶＲ增殖膜的靶向性基因转染作用（在正常视网膜组织未见报告基因的表达）及安全性；实验二用逆转录病毒载体携带自杀基因（ＨＳＶ—ｔｋ）导入ＰＶＲ模型眼内，再给予丙氧鸟苷后，证实其可以抑制ＰＶＲ的形成和发展０／本实验的特点是：①在增殖膜已初步形成时进行ＰＶＲ基因治疗实验研究；②基因转染方

法为体内直接基因转染。ｊ

实一验一

ｒｆ逆转录病毒载体在ＰＶＲ模型眼内定向转移

报告基因的实验研究

目的：为了探讨体内直接转移基因治疗增殖性玻璃体视网膜病变（ＰＶＲ）的可行性，我们用口一半乳糖苷酶基因（１ａｃＺ基因）作为报告基因，以逆转录病毒载体携之直接注入ＰＶＲ模型眼玻璃体腔中，观察其在ＰＶＲ模型眼各组织表达情况，为今后眼内直接转移目的基因（如自杀基因）治疗ＰＶＲ提供依据。

方法：将ＰＬＸＳＮ／ＩａｃＺ质粒导入ＰＡ３１７细胞，经筛选抗性克隆及克隧扩增后制备ＰＬＸＳＮ／ｌａｃＺ复制缺陷病毒。选用２～３Ｋｇ重的有色家兔３０只，实验组２０只（选２０眼），对照组ｌＯ只（选１０眼），麻醉后制作ＰＶＲ模型。在注入成纤维细胞后第６天实验组玻璃体注入０．ＩｍｌＰＬＸＳＮ／ｌａｃＺ病毒上清液（１．１×１０６ｃｆｕ／ｍｌ，对照组注入０．ｉｍｌＰＬＸＳＮ／１ａｃＺ质粒ＤＮＡ５０ｐｇ分别进行基因转染。基因转染后第１０天、第３０天分别取出眼球，去掉眼前节行Ｘ—ｇａｌ组化染色。另选２只动物（２眼）不作ＰＶＲ模型，而将其玻璃体腔各注入同实验组剂量的ＰＬＸＳＮ／ＩａｃＺ病毒上清液，术后３０天取出眼球，光镜及电镜检查其视网膜结构，以确定此种疗法的视网膜毒性作用。

结果：对照组术后Ｘ—ｇａｌ组化染色结果显示玻璃体增殖膜组织、视网膜组织及其它眼球壁组织均未见到ｌａｃＺ基因的表达。实验组基因转染后ｌＯ天时可见ｌＯ例中玻璃体增殖膜组织均有１ａｃＺ基因表达，表达主要位于增殖膜的表面呈蓝染，而视网膜组织未见２

有］ａｃＺ的表达：基因转染后３０天时ｌＯ例中有９例可见玻璃体增殖膜组织有ｌａｃＺ基因表达，亦未见主见网膜组织及其它眼组织有ｌａｃＺ基因表达。未作ＰＶＲ模型而玻璃体腔单纯注入ＰＬＸＳＮ／ｔａｃＺ病毒上清液之两例，术后３０天光镜及电镜检查均未见有视网膜变性等异常变化，也未见明显炎性细胞浸润。

结论：本实验将复制缺陷型ｐＬＸＳＮ／ｌａｃＺ逆转录病毒注入ＰＶＲ模型眼玻璃体腔后，证实报告基因在玻璃体增殖膜表达至少３０天以上，这说明了ＰＶＲ基因治疗的可行性，同时未见在视网膜组织有报告基因的表达，则证明了逆转录病毒载体用于ＰＶＲ的基因治疗具有靶向性作用。基因表达主要位于增殖膜的表面提示本方法可能对早期ＰＶＲ（增殖膜较细小）有较好的治疗效果。本实验未见实验动物有全身感染征象，光镜及电镜检查视网膜组织亦未发现局部毒性作用，因而说明本方法是安全可靠的。本实验在制作ＰＶＲ模型后，直接基因转染增殖膜组织，与临床情况极为接近，临床应用性较强。本实验为以后应用目的基因（如自杀基因，它的导入和表达可使靶组织自我消亡）进行ＰＶＲ基因治疗提供了实验依据。

实验二

逆转录病毒载体介导自杀基因

防治ＰＶＲ的实验研究

目的：实验～己证实用逆转录病毒载体可以将外源基因定向导入ＰＶＲ的增殖膜组织，这说明了ＰＶＲ基因治疗的可行性。为进一步探讨外源基因对ＰＶＲ的治疗效果，我们选用单纯疱疹胸苷激酶基因（ＨＳＶ—ｔｋ）作为治疗基因，以逆转录病毒载体携之直接注入ＰＶＲ模型眼玻璃体腔中，再给予丙氧鸟菅（ＧＣＶ），观察其对ＰＶＲ的治疗

效果，以期为将来临床ＰＶＲ的基因治疗提供实验基础。

方法：将ＰＬＸＳＮ／ｔｋ质粒导入包装细胞，经筛选、扩增制备ＰＬＸＳＮ／ｔｋ复制缺陷病毒。选用２～３Ｋｇ重的有色家兔２４只，分为四组（每组１２眼），每眼均先注入成纤维细胞进行ＰＶＲ模型制作。第一组各眼在注入成纤维细胞后第６天时玻璃体注入０．ＩｍｌＰＬＸＳＮ／ｔｋ病毒上清液（１．６×】Ｏ‘ｓｆｕ／ｍ］），第９天及第１３天分别玻璃体注入２ｍｇ／ｍｌ的ＧＣＶ０ｌｍｌ。第二组各眼注入成纤维细胞后第６天时注入与第一组相同剂量的ＰＬＸＳＮ／ｔｋ病毒上清液，而第９天及第１３天分别注入生理盐水０．Ｉｍｌ。第三组各眼在注入成纤维细胞后第６天注入生理盐水０．Ｉｍｌ，第９、１３天分别注入与第一组相同剂量的ＧＣＶ。第四组注入成纤维细胞后第６、９、１３天分别注入生理盐水０．Ｉｍｌ。术后以裂隙灯及检眼镜检查各眼玻璃体及眼底情况，并记录ＰＶＲ的形成情况。

结果：以是否发生视网膜脱离为界，将ＰＶＲ形成情况分为病变轻微和病变严重，经统计学处理证实第一组较其它三组ＰＶＲ形成轻微，有明显差异（ｐ＜Ｏ．０５）。

结论：本实验在制作ＰＶＲ模型后，以逆转录病毒载体介导ＨＳＶ—ｔｋ基因导入增殖膜组织，再给予ＧＣ７，证实其对ＰＶＲ的形成和发展有明显的抑制作用，且未见明显的眼部炎症反应。本实验使用直接体内转移的方法，与临床实际应用接近，为今后ＰＶＲ的基因治疗提供了直接的实验基础。７ｆ一、—７

｝

关键词

载体增殖性玻璃体视网膜病变基因治疗逆转录病毒Ｂ一半乳糖苷酶基因胸营激酶基因４

ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＳｔｕｄｙ

ＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｏｎＰｒｅｖｅｎｔｉｏｎｏｆＶｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙｗｉｔｈＥｘｏｇｅｎｏｕｓＧｅｎｅＭｅｄｉａｔｅｄｂｙＲｅｔｒｏｖｉｒａｌＶｅｃｔｏｒ

Ｄｏｃｔｏｒａｌ

ＤｏｃｔｏｒａｌｃａｎｄｉｄａｔｅｔｕｔｏｒＰｒｏｆ．ＷａｎＧｕａｎｇｍｉｎｇＺｅｎｇＳｈｕｉｑｉｎｇＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｐｈｔｈａｌｍ０１０９ｙ，ＵｎｉｏｎＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＴｏｎｇｊｉ

Ｍｅｄｉｃａ］Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ

Ａｂｓｔｒａｃｔ

Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ

ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ

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ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎａｌｓｕｒｇｅｒｙｃａｎｎｏｔｐｒｅｖｅｎｔｔｈｅ

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ＭＥＴＨＯＤＳ

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ＰＶＲｍｅｍｂｒａｎｅ，ａｎｄ

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Ｐａｒｔ２

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ｅｙｅｒｅｃｅｉｖｅｄｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａ］ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｆ０．Ｉｒａ］ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ］ｓａｌｊｎｅｉｎ６ｔｈｄａｙ．ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙＧＣＶｉｎｊｅｃｔｉＯｎＳｓａｍｅａｓｇｒｏｕｐ１．Ｉｎｇｒｏｕｐ４．ｔｈｒｅｅｔｉｍｅｓｉｎｊｅｃｔｊｏｒｓｏｆ０．１ｍｌｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａ］ｓａｌｉｎｅｉｎ６ｔｈ，９ｔｈ，１３ｔｈｄａｙｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙａｆｔｅｒｔｈｅｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．ｔｈｅｅｙｅｓｗｅｒｅｅｘａｍｉｎｅｄｂｙｏｐｈｔｈａｌｍｏｓｃｏｐｙａｎｄｓｌｉｔ—ｌａｍｐｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ，ｔｈｅｓｔａｇｅｓｏｆＰＶＲｉｎｅａｃｈｅｙｅｗｅｒｅｒｅｃｏｒｄｅｄｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｉｍｅ．

ＲＥＳＵＬＴＳＴｈｅｓｉｔｕａｔｉｏｎｏｆＰＶＥｗａｓｔｈｏｕｇｈｔｔｏｂｅＳｅＴｊＯＵＳｉｆｔｈｅｒｅｗａｓｔｈｅｒｅｔｉｎａｌｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ．ＴｈｅｒｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅａｓｃｏｍｐａｒｅｇｒｏｕｐｌｔｏｏｔｈｅｒｔｈｒｅｅｇｒｏｕｐｓｉｎｄｅｇｒｅｅｏｆＰＶＲ（ｐ＜Ｏ．０５）．

ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮＳＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆＨＳＶ—ｔｋｇｅｎｅｍｅｄｉａｔｅｄｂｙｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｉｎｔｏＰＶＲｍｅｍｂｒａｎｅ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｇｉｖｉｎｇ

ａｎｏｂｖｉＯＵＳｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｎｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆ

ＰＶＲ．Ｎｏａｐｐａｒｅｎｔｓｉｄｅｅｆｆｅｃｔｗａｓｓｅｅｎ．ＴｈｉｓｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｉｓｃｌｏｓｅｔｏｃｌｉｎｉｃａｌｐｒａｃｔｉｃｅｏｆＰＶＲ，ａｎｄｈａｓｐｒｏｖｉｄｅａｎｏｖｅｌｗａｙｆｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｉｔ．

ＫＥＹＷＯＲＤＳＰｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｖｉｔｒｅｏｒｅｔｉｎｏｐａｔｈｙＧｅｎｅ

ＲｅｔｒｏｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒＬａｅＺｇｅｎｅＴｈｙｍｉｄｉｎｅｋｉｎａｓｅ

０ＧＣＶ，ｈａｓｔｈｅｒａｐｙｇｅｎｅ

实验一

逆转录病毒载体宅Ｅ－ＰＶＲ模型眼内定向转移

报告基因的实验研究，

日Ｕ吾

基因治疗为疾病的治疗开辟了一条新途径，逆转录病毒载体以其对增殖细胞靶向性转染的特点而在肿瘤等增殖性疾病的基因治疗中显出巨大优势。增殖性玻璃体视网膜病变（ＰＶＲ）是一种眼内增殖性疾痫，在眼外伤或视网膜脱离术后等情况下，成纤维细胞、视网膜色素上皮细胞、胶质细胞等增殖细胞向玻璃体内迁移，在玻璃体腔及视网膜表面形成增殖膜，增殖膜收缩后可导致牵引性视网膜脱离。Ｋｉｍｕｒａ等…、李大宇等Ⅲ、Ｓａｋａｍｏｔｏ等‘”曾用逆转录病毒载体携带自杀基因抑制成纤维细胞在眼内的生长，并取得了较好的效果，但目前尚未见在ＰＶＲ早期增殖膜进行基因转染及治疗的报导。为了探讨基因疗法直接在眼内应用以防治ＰＶＲ的可行性，我们用Ｂ一半乳糖苷酶基因（１ａｃＺ基因）作为报告基因，以逆转录病毒载体携之直接注入增殖膜已初步形成的ＰＶＲ模型眼玻璃体腔中，应用组化方法检测其表达情况，以确定ＰＶＲ眼各组织被基因转染情况，为以后用目的基因（如自杀基因）直接体内基因治疗ＰＶＲ提供依据。

材料和方法

一、逆转录病毒载体ＰＬＸＳＮ／ＩａｃＺ及其包装和滴度测定

逆转录病毒表达载体ＰＬＸＳＮ／ＩａｃＺ及ＰＡ３１７细胞、ＮＩＨ／３Ｔ３细胞分别由李大宇博士及同济医大免疫教研组惠赠。用脂质体转染试剂Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ介导，将逆转录病毒表达载体ＤＮＡ导入ＰＡ３１７细胞，以Ｇ４１８筛选抗性克隆，抗性克隆经转移扩增后，收集上清，用ＮＩＨ／３Ｔ３细胞测其病毒滴度ｏ…。具体过程如下：

（一）质粒的大量提取．

１、主要仪器

恒温摇床（武汉，ＨＹＡ型）

普通离心机（北京医用离心机厂，ＬＤ４－２型）

低温超速离心机（德国Ｈｅｒａｅｕｓ）

低温冰箱（德国ＢＯＳＣＨ）

真空泵（上海长江医疗器械厂，ＹＱ０２．３０型）

紫外可见分光光度计（日本Ｓｈｉｍａｄｙｕ，ＵＶ一２４０型）

２、主要材料和试剂

（１）含ＰＬＸＳＮ／ｌａｃＺ质粒的菌种（ＤＨ。。），由李大宇博士惠赠。（２）ＬＢ液体培养基的制备：（０．５％）１克精解蛋白胨（上海禽蛋二厂，生化试剂）。（１％）２克酵母浸出粉（上海酵母厂，生化试剂）。（０．５％）１克氯化钠（上海南汇彭镇营房化工厂，分析纯）。（１％）２克葡萄糖（上海化学试剂采购供应站，分析纯）。将上述试剂用双蒸水溶解至２００ｍｌ，用ＮａＯＨ调ｐＨ至７．４，装于５００ｍｌ三角烧瓶中。１．０３４×１０５帕高压蒸气灭菌２０分钟。

（３）质粒ＤＮＡ大量制备纯化试剂盒（Ｗｉｚａｒｄ

ＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＰｌｕｓＭａｘｉｐｒｅｐｓＳｙｓｔｅｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ公司生产）

细胞悬浮溶液：

５０ｒａｍＴｒｉｓ—ＨＣＬ，ｐＨ７，５

ｌＯｍＭＥＤＴＡ

１００ｕｇ／ｍｌＲＮａｓｅＡ

细胞裂解液：

０．２ＭＮａＯＨ

ｌ％ＳＤＳ

复性溶液：

１．３２ＭＫＡｃ，ｐＨ４．８

柱洗溶液：（加入乙醇后的终浓度）

８０ｒＩｌＭＫＡｃ

８．３ｍＭＴｒｉｓ—ＨＣＬ，ｐＨ７．５

４０ｒａｍＥＤＴＡ

，

５５％Ｅｔｈａｎｏｌ

ＴＥ缓冲液：

ｌＯｍＭＴｒｉｓ—ＨＣＬ，ｐＨ７．５

ｌｍＭＥＤＴＡ

ＤＮＡ纯化胶

过滤柱

（４）其它：

异丙醇

经过消毒的双蒸水

ｌＯｍｇ／ｍｌ氨苄青霉素

３、方法

（１）菌种的培养：取２（２）备好的ＬＢ培养基，加入浓度为ｌＯｍｇ／ｍｌ的氨苄青霉素。２ｍｌ。接种菌液后，置３７＂Ｃ恒温摇床振荡

培养过液（１５０转／分）。

（２）质粒的提取

Ａ：将培养物转入４个５０ｍｌ塑料离心管内，每管５０ｍｌ，于室温下２５００ｒｐｍ离心２０分钟。弃上清，将离心管倒立，使上清流净。每管加入３，７５ｍｌ细胞悬浮溶液并搅拌使细菌完全重悬于溶液中。合并４个离。ｂ管中之溶液。

Ｂ：加入１５ｍｌ细胞裂解液，并轻轻混匀，当溶液变的透明而粘稠时说明已充分裂解（约需２０分钟）。

Ｃ：加入１５ｍｌ复性溶液，温和翻转数次。２ｊ℃，１４，０００９离心１５分钟。

Ｄ：将上清液转移至一干净的ＩＯＯｍｌ量筒，测量上清的体积，然后将上清移至一新的５０ｍｌ离心管。

Ｅ：室温下加入０．５体积的异丙醇并混匀，放置１０分钟。２ｊ℃，１４，０００９离心１５分钟。

Ｆ：去除上清，用２ｍｌＴＥ缓冲液使ＤＮＡ沉淀重悬。

Ｇ：将ＤＮＡ纯化胶摇匀后，加ｌＯｍｌ于上液，混匀。

Ｈ：将过滤柱的头端与真空源相连接。

Ｉ：将纯化胶／ＤＮＡ混合液全部移入过滤柱针筒，接通真空源，使此混合液进入过滤柱。

Ｊ：加入２５ｍｌ柱洗溶液，接通真空源使之通过过滤柱。

Ｋ：加入８０％乙醇５ｍｔ并接通真空源使之通过过滤柱以洗去纯化胶。将过滤柱插入一５０ｍｌ离心管，１３００９离心５分钟，然后取出过滤柱重新与真空源接通５分钟。

Ｌ：将过滤柱插入一新的５０ｍｌ离心管，加入１．５ｍ１预热至６５－－７０℃的双蒸水至过滤柱，等待１分钟后，ｌ，３００９离心５分钟以洗脱ＤＮＡ。

Ｍ：将～个５ｍ１塑料注射器拔出内芯推液筒后与０．２Ｉａｍ滤器相接，用移液器将ＤＮＡ沈脱液移入注射器内，小心插入注射器推液筒，推之使ＤＮＡ洗脱液滤至～个１．５ｍｌＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（Ｅｐ）管内。

Ｎ：１４，０００９离心１分钟后，立即将上清移入一新的Ｅｐ管内，保存于４℃或一２０℃。

（３）应用紫外可见分光光度计对ＤＮＡ浓度与纯度进行测定

（二）重组逆转录病毒的包装

１、主要仪器

二氧化碳细胞培养箱（美国ＳＨＥＬＤＯＮ公司，２３００型）

超净工作台（南通科学仪器厂）

倒置生物显微镜（重庆光学仪器厂）

２、主要材料和试剂

ＤＭＥＭ细胞培养基（美国ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司）

小牛血清（美国ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司）

ＨＥＰＥＳ（德国Ｂ．Ｍ．公司）

Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（美国ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ公司）

Ｇ４１８（德国Ｂ．Ｍ．公司）

３、脂质体介导逆转录病毒载体导入包装细胞（参阅Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ产品说明书）

在ＤＮＡ转染前１天，选择生长状态良好的ＰＡ３１７细胞，用胰蛋白酶消化后按２Ｘ１０５的细胞数接种在６孔板内，置３７。Ｃ、５％ｃＯ。培养箱内培养２４小时。当ＰＡ３１７细胞生长达６０％～７０％左右汇合时，即可供转染用。

（１）收获ＰＡ３１７细胞，将ｌ～２Ｘ１０５细胞重悬于２ｍｌ完全培养基中（ＤＭＥＭ），接种于６孔培养板内，３７＂Ｃ、５％Ｃ０，培养箱培养１８～２４小时，使细胞达５０～８０％的融合。