羟苯磺酸钙对酶法游离脂肪酸检测的负干扰

羟苯磺酸钙对酶法游离脂肪酸检测的负干扰 羟苯磺酸钙对酶法游离脂肪酸检测的负干扰

侯立安1， 国秀芝1， 邱　玲1， 程歆琦1， 张　波2， 禹松林1， 方慧玲1， 赵　芳1， 刘　茜1

（1.中国医学科学院北京协和医院检验科，北京 100730；2.中国医学科学院北京协和医院药剂科，北京 100730）

摘要：目的 探讨羟苯磺酸钙对6种酰基辅酶A合成酶（ACS）-过氧化物酶偶联法（简称ACS酶法）检测游离脂肪酸（FFA）的干扰及对临床的影响。方法 用去离子水配制不同浓度羟苯磺酸钙溶液，添加到2种不同FFA浓度（550和1 200 μmol/L）基础血清中，药物终浓度分别为0、2、4、8、16、32、64 μg/mL。用6种ACS酶法试剂盒（以A、B、C、D、E、F随机顺序编号）测定添加了药物溶液的血清FFA浓度，计算与药物浓度为0 μg/mL时的百分偏差，以±5%作为干扰可接受范围。采用高效液相色谱法（HPLC）监测志愿者服药前、后血清中羟苯磺酸钙浓度变化与时间[服药前及0（即药物浓度达稳态后的谷浓度）、1、2、3、4、6 h]的关系，并测定40例临床服用羟苯磺酸钙患者的血清药物浓度。结果 羟苯磺酸钙药物稳态谷浓度（0 h）[中位数（四分位数间距）]为6.64（5.64～7.86）μg/mL；服药500 mg后，药物浓度在2～3 h达峰值，峰浓度为15.00（13.63～19.67）μg/mL，随后逐渐下降。40例服药患者血清中羟苯磺酸钙的平均浓度为11.92（5.45～19.22） μg/mL。在体外实验中，随着血清中羟苯磺酸钙浓度的增加，FFA检测结果的受干扰程度亦相应增强。当血清中羟苯磺酸钙浓度为8 μg/mL时，6种试剂盒检测低浓度（550 μmol/L）、高浓度（1 200 μmol/L）FFA的偏差为-0.40%～-65.01%和-0.20%～-52.33%，除B、D 2种试剂盒外，其他4种试剂盒的干扰程度均在可接受范围内。当血清中的羟苯磺酸钙浓度为16 μg/mL时，6种试剂盒检测低、高浓度FFA的偏差分别为-1.68%～-28.28%和-1.81%～-16.48%，除A试剂盒和C试剂盒（高浓度FFA）外，其他试剂盒及C试剂盒（低浓度FFA）的检测结果均明显超出了干扰可接受范围。干扰程度也与基础血清的FFA浓度有关，在同一药物浓度下，FFA浓度越低，干扰越明显。结论 羟苯磺酸钙对ACS酶法检测FFA会产生不同程度的负干扰，应引起重视。

关键词：游离脂肪酸；羟苯磺酸钙；酶法；干扰

游离脂肪酸（free fatty acid，FFA） 是脂肪代谢的中间产物，主要由皮下和内脏脂肪脂解产生。FFA既是细胞膜脂质结构和前列腺素合成的供体，也是人体的重要能源物质之一[1]。FFA因与2型糖尿病等相关疾病的关系密切而被广泛研究。FFA增高对胰岛素抵抗及胰岛β细胞功能的影响有着不可忽视的作用[2-3]。韩乐等[4]在对糖尿病肾病的研究中发现，FFA能够抑制人近曲肾小管上皮细胞的增殖，促进该细胞的凋亡。此外，FFA还参与了动脉粥样硬化形成过程中的炎症反应及内皮功能损伤，是心血管疾病的危险因素之一[5]。因此，近年来临床对FFA的关注度越来越高。目前，FFA的实验室检测主要有酶法、气相色谱法等。其中，基于偶联终点比色（Trinder）反应原理的酰基辅酶A合成酶（acetyl-coenzyme A synthetase，ACS）-过氧化物酶法（简称ACS酶法）因具有简便、快速等优势，已成为临床实验室检测FFA的常用方法。

羟苯磺酸钙是一种微血管保护剂，广泛应用于糖尿病合并眼底病变的治疗。该药在人体内以基本原型存在，通过肾脏和肠道排泄[6]。在以前的研究中，我们发现羟苯磺酸钙对基于Trinder反应的8种酶法检测肌酐均可产生明显的负干扰[7]，同时对基于Trinder反应的7种尿酸酶-过氧化物酶偶联法检测尿酸也有明显的负干扰[8]。FFA的检测也使用了过氧化酶指示系统。为此，我们研究了羟苯磺酸钙对6种ACS酶法检测FFA的影响。

材料和方法

一、研究对象

1.志愿者 选取的志愿者与国秀芝等[8]的研究中选取的志愿者相同。招募10名年龄为20～50岁的志愿者进行体内药物代谢实验，其中男6名、女4名。志愿者肝、肾功能均正常，近期（1周内）未患疾病，未服用其他任何药物。本研究已通过北京协和医院伦理委员会批准，受试者均已阅读并签署知情同意书。

2.服用羟苯磺酸钙的患者 通过医院信息系统查询并选取北京协和医院住院患者中服用羟苯磺酸钙患者40例，收集其临床检验后的剩余血清样本。

3.体外干扰实验基础血清 参考美国临床实验室标准化协会（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）EP7-A2文件[9]，选择适合于临床应用的正常值（550 μmol/L）和异常值（1 200 μmol/L）的FFA浓度。对2015年8月北京协和医院的健康体检者进行体检和问卷调查，留取肝肾功能正常、近期未服用过任何药物的体检者的检测剩余血清，配制混合血清，血清要求无溶血、黄疸和脂血。

二、仪器与试剂

1.ACS酶法试剂盒（1）德赛诊断系统（上海）有限公司（简称德赛）提供的FFA酶法试剂盒及校准品，批号为20717/00002360；（2）宁波美康生物科技股份有限公司（简称美康）提供的FFA酶法试剂盒及校准品，批号为15062301；（3）北京九强生物技术股份有限公司（简称九强）提供的FFA酶法检测试剂盒及校准品，批号为15-0616；（4）北京利德曼生化股份有限公司（简称利德曼）提供的FFA酶法试剂盒及校准品，批号为508171H；（5）日本和光纯药工业株式会社（简称和光）提供的FFA酶法试剂盒及校准品，批号为EL140；（6）日本积水医疗株式会社（简称积水）提供的FFA酶法试剂和校准品，批号为813RAM。以上6种ACS酶法试剂盒以A、B、C、D、E、F随机顺序编号。质控品使用Bio-Rad公司生产的Liquid Assayed Multiqual化学质控品（694/696两水平，批号为45681/45683）。仪器为BECKMAN-COULTER AU5800全自动生化分析仪（美国Beckman-Coulter公司）。该生化分析仪为医院常规在用检测仪器，性能稳定，运行状况良好。

2.实验药物 西安利君制药公司生产的羟苯磺酸钙胶囊，商品名为多贝斯；批号为1212180-1。

三、方法

1.服药后血清羟苯磺酸钙浓度变化与时间的关系 服药前采集10名志愿者静脉血，离心分离血清，作为基础空白血清，随后连续3 d按临床常规用药方式，每天3次，每次500 mg口服羟苯磺酸钙。按药代动力学信息，第4天药物浓度可达稳态[6，10]。清晨采集志愿者血清作为谷浓度（0 h），再次口服500 mg羟苯磺酸钙，分别在服药后1、2、3、4、6 h采集静脉血，分离血清，采用高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）测定血清中羟苯磺酸钙原型药物浓度。

2.临床患者血清药物浓度评估 采用HPLC法测定40份服药患者血清中羟苯磺酸钙浓度。

3.体外干扰实验 根据羟苯磺酸钙的药代动力学信息，单次口服500 mg后，约6 h达峰浓度（8 μg/mL左右）[6，10]。目前常规临床计量下药物的稳态浓度约为15 μg/mL[6]。参考CLSI EP7-A2文件，将羟苯磺酸钙用去离子水分别配制成不同浓度溶液，混匀，分别添加到2份干扰实验基础血清中，使最终基础血清中药物终浓度分别为0、2、4、8、16、32、64 μg/mL。在BECKMAN-COULTER AU5800全自动生化分析仪上同时安装6种FFA酶法试剂盒，定标，质控在控后对每个浓度血清各测定3次，求均值，计算不同药物浓度下FFA浓度与药物浓度为0 μg/mL时的FFA浓度的百分偏差（%）。因我国国家卫生计生委临床检验中心及美国病理学家协会（the College of American Pathologists，CAP）均没有FFA室间质评，因此目前各实验室对FFA的评估方法为室间比对。本实验室目前比对的偏差约为±5%，因此以FFA偏差±5%作为干扰实验的临床可接受标准。

四、统计学方法

应用MedCalc v 13.3.3软件进行统计分析和绘图。计量资料以中位数（范围）表示。

结　果

一、志愿者体内药物代谢实验

10名志愿者第4天羟苯磺酸钙药物浓度达稳态后的谷浓度（0 h）为6.64（2.66～8.33）μg/mL；服药500 mg后，药物浓度在2～3 h达峰值，峰浓度为15.00（12.83～23.15）μg/mL，随后逐渐下降。见图1。

图1　10名志愿者服药后不同时间羟苯磺酸钙血药浓度变化

二、临床患者血清药物浓度

40例服药患者血清中羟苯磺酸钙平均浓度为11.92（1.27～63.35）μg/mL。

三、体外干扰实验

外源添加药物羟苯磺酸钙，对FFA的检测产生负干扰。随着血清中羟苯磺酸钙浓度的增加，对FFA检测结果的干扰程度亦相应增大。

当血清中羟苯磺酸钙浓度为8 μg/mL时，B试剂盒和D试剂盒检测低（550 μmol/L）、高浓度（1 200 μmol/L）FFA的干扰程度分别为-9.50%、-5.87%和-15.44%、-7.74%，均高于干扰可接受范围，其他4种试剂盒的干扰程度均在可接受范围内。

当血清中的羟苯磺酸钙浓度为16 μg/mL时，A试剂盒检测低浓度、高浓度FFA的结果与空白血清的偏差分别为-1.68%和-1.81%，均在可接受范围内；C试剂盒检测低浓度、高浓度FFA的结果与空白血清的偏差分别为-5.63%和-4.40%，低浓度FFA的干扰程度超出了可接受范围，而高浓度FFA的干扰程度仍在可接受范围内；其他4种试剂盒的检测结果均明显超出了干扰可接受范围。

当血清中羟苯磺酸钙浓度为64 μg/mL时，低浓度、高浓度FFA检测干扰最大可达到-65.11%和-52.33%。

干扰程度也与基础血清的FFA浓度有关，在同一药物浓度下，FFA浓度越低，干扰越明显。见表1、图2。

表1　不同羟苯磺酸钙浓度下FFA浓度与空白血清的百分偏差　（%）

FFA（μmol/L）试剂盒羟苯磺酸钙（μg/mL）0 2 4 8 163264 550A0-0.40-0.58-0.98-1.68-3.53-6.53 B 0-2.23-4.47-9.50-16.76-30.73-54.19 C 0-0.60-1.57-2.72-5.63-11.25-20.15 D 0-5.18-8.11-15.44-28.28-46.14-65.11 E 0-0.60-2.06-3.85-7.16-13.61-24.35 F 0-0.85-0.44-3.54-6.36-12.54-21.44 1 200A0-0.16-0.90-0.66-1.81-3.29-5.12 B 0-1.53-3.06-5.87-10.71-19.90-37.76 C 0-0.20-0.45-1.35-4.40-8.93-17.28 D 0-2.35-4.60-7.74-16.48-30.09-52.33 E 0-0.47-1.43-2.42-5.07-10.04-18.19 F 0-1.07-1.62-3.02-6.16-10.03-19.28

图2　不同羟苯磺酸钙浓度下FFA浓度与空白血清的偏差

注：（a）550 μmol/L FFA；（b）1 200 μmol/L FFA；

　　A试剂盒；

　　B试剂盒；

　　C试剂盒；

　　D试剂盒；

　　E试剂盒；

　　F试剂盒

讨　论

羟苯磺酸钙作为一种微血管保护剂，对临床检验项目的干扰早在1986年就已被报道[11]，但一直未引起重视。本实验室采用不同检测系统检测肌酐时，临床医师关注到患者肌酐检测值短期内波动较大，从而使本实验室意识到该药物对肌酐的检测存在负干扰。羟苯磺酸钙主要应用于糖尿病性视网膜病[12]，近年来用药量逐年升高。据统计，2014年北京协和医院有13 599例患者服用羟苯磺酸钙。而FFA与2型糖尿病、胰岛素抵抗密切相关，FFA升高可抑制外周血葡萄糖的利用[13]。同时，FFA作为脂肪代谢的中间产物，参与了体内多种物质的合成过程。

本研究通过体外干扰实验证实羟苯磺酸钙对ACS酶法检测FFA存在负干扰。当血清中的羟苯磺酸钙浓度为16 μg/mL时，FFA的检测结果仅A试剂盒和C试剂盒（高浓度FFA）在可接受范围内，其他试剂盒的检测结果均受到较大程度干扰。基础FFA浓度越低，受干扰程度越大，并且随药物浓度的增高，干扰程度逐渐增强。该药物干扰经初步分析，可能是Trinder反应过程中产生的过氧化氢与羟苯磺酸钙结构中所含的对苯二酚环反应，导致过氧化氢被消耗[7-8]。在同一药物浓度下，FFA含量越低，ACS-过氧化物酶偶联反应产生的过氧化氢越少，对FFA检测结果的影响就越大。不同检测系统受干扰的程度不同，推测可能与试剂中参与Trinder反应的色原结构及样本和试剂的比例有一定关系，具体原因有待进一步研究。

因FFA受饮食等多种因素的影响，在人体内的生理变异较大，本研究实验设计上要考虑因素过多，并且FFA检测无参考方法，无法得知临床患者服药后体内真实的FFA水平，因此本研究未做体内干扰实验，但可通过志愿者和患者药物浓度以及体外干扰实验的结果来推测体内干扰的严重程度。本研究测定了志愿者和临床患者血清中羟苯磺酸钙浓度，10名志愿者药物浓度达稳态后的血药峰浓度为12.83～23.15 μg/mL。40例服药患者血清中羟苯磺酸钙浓度最高可达63.35 μg/mL。由体外干扰实验结果推测，临床患者服药期间采用ACS酶法检测FFA将产生明显的负干扰，并且不同的采血时间和不同的检测系统会使FFA的检测结果产生很大波动。而这种由药物干扰造成的波动容易被当成饮食等因素的影响而被临床医生忽视，应当引起重视。

羟苯磺酸钙对ACS酶法检测FFA的负干扰具有重要的临床价值，应当引起检验技术人员的重视。临床医师也应对服用羟苯磺酸钙的患者选择合适的时间采血，肾脏病患者应适当延长服药与采血之间的时间间隔，并对FFA检测结果谨慎判断，以免影响治疗。

参考文献

[1]王昌敏，孟晓辉，宋金萍，等. 两种酶法测定血清游离脂肪酸试剂盒的分析性能比较[J]. 标记免疫分析与临床，2013，20（6） ：443-445.

[2]陈杰，杨昱，吴阳，等. 血清游离脂肪酸与2型糖尿病患者糖脂代谢相关性的研究[J]. 中国实用医药，2011，6（32）：134-135.

[3]陆秋涯，迟贞旎，陆怡德. 空腹血清游离脂肪酸与2型糖尿病的关系[J]. 检验医学，2012，27（9）：725-727.

[4]韩乐，刘晓玲，李荣山，等. 游离脂肪酸对人近曲肾小管上皮细胞HK-2的影响及作用机制[J]. 中国现代医生，2011，49（12）：1-3.

[5]于佳雪，徐亚伟，肖丹，等. 游离脂肪酸与心血管疾病[J]. 现代生物医学进展，2013，13（10）：1979-1982.

[6]BENAKIS A，GLASSON B，BOUVIER CA，et al. Metabolism and pharmacokinetics of calcium dobesilate in humans[J]. Therapie，1974，29（2）：211-219.

[7]GUO X，HOU L，CHENG X ，et al. Strong negative interference by calcium dobesilate in sarcosine oxidase assays for serum creatinine involving the trinder reaction[J]. Medicine（Baltimore），2015，94（23）：e905.

[8]国秀芝，张江涛，侯立安，等. 羟苯磺酸钙对尿酸酶-过氧化物酶偶联法尿酸检测的干扰研究[J]. 中华检验医学杂志，2015，38（9）：600-604.

[9]Clinical and Laboratory Standards Institute. Interference testing in clinical chemistry[S]. EP7-A2，CLSI，2005.

[10]ZHUO HT，BU YS，CAO XM，et al. Relative bioavailability of caecium dobesilate in healthy volunteers[J]. Chin J Clin Pharmacol，2000，16（4）：295-297.

[11]GUDER WG，HOFFMANN GE，HUBBUCH A，et al. Multicentre evaluation of enzymatic method for creatinine determination using a sensitive colour reagent[J]. J Clin Chem Clin Biochem，1986，24（11）：889-902.

[12]JAVADZADEH A，GHORBANIHAGHJO A，ADL FH，et al. Calcium dobesilate reduces endothelin-1 and high-sensitivity C-reactive protein serum levels in patients with diabetic retinopathy[J]. Mol Vis，2013，19：62-68.

[13]李新征，陈宝炳，康云平. 非酒精性脂肪肝患者血清游离脂肪酸与胰岛素抵抗的关系[J]. 检验医学，2012，27（1）：48-49.

（本文编辑：龚晓霖）

Negative interference by calcium dobesilate in enzymatic assays of free fatty acid

HOU Li'an1，GUO Xiuzhi1，QIU Ling1，CHENG Xinqi1，ZHANG Bo2，YU Songlin1，FANG Huiling1，ZHAO Fang1，LIU Qian1.

（1. Department of Clinical Laboratory，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730，China；2. Department of Pharmacy，Peking Union Medical College Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730，China）

Abstract：Objective To investigate the interference of calcium dobesilate in the determination of free fatty acid（FFA） using 6 acetyl-coenzyme A synthetase（ACS）-peroxidase coupled assays and its influence. Methods Calcium dobesilate solution with different concentrations was prepared by pure water，and was added into sera with 2 different FFA concentrations（550 and 1 200 μmol/L）. Serum FFA levels with final concentrations of calcium dobesilate additions（0，2，4，8，16，32 and 64 μg/mL） were determined using 6 ACS enzymatic assays（A，B，C，D，E and F，randomly）. Bias（%） was calculated in serum FFA with final concentration of calcium dobesilate addition（0 μg/mL）. Taking ±5% as an acceptable range of interference，the changes in serum calcium dobesilate levels observed before and after calcium dobesilate administration [baseline，0 h（valley concentration of drug in the stable state），1 h，2 h，3 h，4 h and 6 h]in 40 participants were monitored by high performance liquidchromatography（HPLC）. Serum calcium dobesilate levels in 40 participants from those taking calcium dobesilate were determined. Results The level of serum calcium dobesilate（0 h） [median（interquartile range）]was 6.64（5.64-7.86）μg/mL. After taking 500 mg，the level of serum calcium dobesilate peaked at 2-3 h. The peak level of serum calcium dobesilate was 15.00（13.63-19.67）μg/mL，and then decreased gradually. The average level in 40 participants was 11.92（5.45-19.22）μg/mL. With the increase of serum calcium dobesilate level，the degree of interference in FFA determination also increased in in vitro experiment. For the low and high concentrations（550 and 1 200 μmol/L） of serum FFA，the biases in 6 ACS enzymatic assays were -0.40% - -65.01% and -0.20% - -52.33% in 8 μg/mL serum calcium dobesilate. The interference degrees of 4 ACS enzymatic assays can be accepted，except B and D. The biases in 6 ACS enzymatic assays were -1.68% - -28.28% and -1.81% - -16.48% in 16 μg/mL serum calcium dobesilate. Except kit A and kit C（high concentration of FFA），the interference of other kits and kit C（low concentration of FFA） was beyond the acceptable range. The degree of interference was also related with basic serum FFA concentration. Under same calcium dobesilate concentration，the interference with lower concentration of serum FFA was more obvious. Conclusions In ACS enzymatic assays，calcium dobesilate produces a negative interference in the determination of FFA.

Key words：Free fatty acid；Calcium dobesilate；Enzymatic assays；Interference

文章编号：1673-8640（2016）011-0936-05

中图分类号：R446.1

文献标志码：A

DOI：10.3969/j.issn.1673-8640.2016.011.002

基金项目：首都卫生发展科研专题项目（首发2016-2-4017）

作者简介：侯立安，女，1989年生，学士，技师，主要从事临床生化检验工作。

通讯作者：邱 玲，联系电话：010-69159707。

收稿日期：（2016-01-04）