拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白的亚细胞定位
第38卷第5期
福州大学学报(自然科学版) () Vol . 38No . 5文章编号:1000-2243(2010) 05-0753-05
拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白的亚细胞定位
杨捷, A llan M Showalter 12
(1. 福州大学生物科学与工程学院, 福建福州 350108; 2. 俄亥俄大学环境与植物生物学系, Ohi o A thens 45701, US A )
摘要:为确定拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan -p r otein, AGP ) 的亚细胞定位, 克隆了这个
基因的编码区, 与绿色荧光蛋白(GFP ) 基因构建融合表达载体, 经农杆菌介导转化烟草BY -2悬浮细胞. 利用
激光扫描共聚焦显微镜, 在稳定转化的BY -2细胞表面观察到绿色荧光. 研究结果表明, 此AGP 分布在细胞
膜表面.
关键词:阿拉伯半乳糖蛋白; 绿色荧光蛋白; 亚细胞定位; GP I 锚; 拟南芥; BY -2细胞
中图分类号:Q786 文献标识码:A
Subcellul ar loca li za ti on of a cl a ssi ca l arab i n oga l act an -prote i n fro A rab idopsis
Y ANG J ie , A llan M 12
(1. College of B i ol ogical Science and Technol 350108, China;
2. Depart m ent of Envir on i ol o A thens, OH 45701, US A )
Abstract:I n order t o m l on of a classical arabinogalactan -p r otein
(AGP ) fr regi on was cl oned and fused t o a green fluorescence p r otein
(GFP ) . The GFP -AGP fusi on construct was transf or med int o t obacco BY -2sus pensi on
cells via A g robacterium -mediated transf or mati on . Green fluorescence was observed on the cell surface
of transgenic BY -2cells stably exp ressing the fusi on p r otein . The results indicated that the AGP was
l ocalized t o the p las ma me mbrane, suggesting this AGP is p laying r oles on the cell surface .
Keywords:AGPs; GFP; subcellular l ocalizati on; GP I anchor; A rabidopsis ; BY -2cells
阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan p r oteins, AGPs ) 从属于富含羟脯氨酸的糖蛋白(Hyp -rich glycop r o 2teins, HRGPs ) 家族, 是一类结构复杂的大分子, 广泛分布于植物界的各种组织和细胞中. AGPs 是一类异质性的糖蛋白, 不同AGPs 的糖及蛋白质的含量和组成有很大差异. 它们主要分布在细胞质膜、质膜细胞壁间隙、细胞壁和胞外基质中. 由于AGPs 本身的性质, 可以作为一种添加剂、乳化剂等, 在食品及其他行业中具有重要的工业应用价值.
AGPs 由蛋白质核心链和碳水化合物(糖) 侧链构成, 糖基部分通常占整个分子质量的90%以上. 糖基主要由阿拉伯糖和半乳糖构成, 以多聚糖的形式存在, 通过O -糖苷键和羟脯氨酸(Hyp ) 残基的-OH 基
[1]相连. 蛋白质部分富含羟脯氨酸(Hyp ) 、丙氨酸(A la ) 、丝氨酸(Ser ) 和苏氨酸(Thr ) .
[2]根据AGPs 不同的蛋白骨架构成形式, 可分为:经典AGPs 、非经典AGPs 、AG 肽、嵌合AGPs 等.
经典AGPs 的蛋白骨架包含:N -端信号序列、富含Hyp /Pro 、A la 、Ser 、Thr 且长度可变的AGP 结构域和C -端疏水区. 长度可变区有时被一个短的富含赖氨酸(Lys ) 的碱性区所间断, 如西红柿中的Le AGP1, 因此这类AGPs 又被称为富含赖氨酸的AGPs (Lys -rich AGPs ) . 在成熟的AGP 分子中, C -端疏水区常被GP I 锚定区(glycosyl phos phatidylinosit ol, GP I anchor ) 所取代. 虽然在植物中, 对含有GP I 锚的蛋白的研究才起步, 但是已发现这些蛋白同动物、酵母中含有GP I 锚的蛋白一样, 通过C -端GP I 锚固定在细胞膜外表
[3]面.
收稿日期:2010-01-14
通讯作者:A llan M Showalter (1956-) , 教授, E -mail:showalte@ohio . edu
基金项目:美国国家科学基金资助项目(I B N -0110413
)
・7
54・福州大学学报(自然科学版) 第38卷 根据AGPs 的蛋白特征(富含Hyp 、A la 、Ser 、Thr ) , Schultz 等利用生物信息学在A rabidopsis 基因组中
[2]检索出了47个可能的AGP 基因, 包括16个含有GP I 锚的经典AGP 基因. 在最近的一次搜索中, 经典
AGPs 的数目已经增加到85个[4]. 在经典AGPs 中, 有三个像Le AGP1一样含有一个短的碱性区, 这三个AGPs 分别被命名为A t A GP17、A t A GP18和A t A GP19.
虽然目前植物中AGPs 的功能尚未有定论, 但AGPs 可能参与细胞间的信息交流和相互识别、细胞和
[1]细胞之间或细胞和基质之间的粘附, 以及细胞和环境的相互作用. 在动物及酵母中, 含有GP I 锚的蛋白
在细胞间的信号传导中起重要作用; 几乎所有经典AGPs 和AG 肽都可能含有GP I 锚, 进一步表明AGPs 可能在细胞表面发挥功能[3]. 蛋白功能的解析往往从蛋白在细胞内的定位开始. 到目前为止, Le AGP1、
[5-8]A t A GP17和A t A GP18都已被成功定位, 而A t A GP19的细胞内分布尚未明朗. 本研究利用绿色荧光蛋
白(GFP ) 及转基因烟草悬浮细胞对拟南芥中的一个经典AGP, A t A GP19(A t1g68725) 进行了亚细胞定位研究, 为进一步阐明该蛋白的生物学功能奠定了基础.
1 材料与方法
1. 1 材料
所用试剂和药品购自Q I A GE N 、SI G MA 和I nvitr ogen 等公司.
-1野生型烟草BY -2(N icotiana tabacum L. cv . ) -1in 转速的摇床
进行培养, 每周继代一次.
野生型拟南芥(A rabidopsis -0, 16h 光照/8h 黑暗.
1. 2 方法
1. 2. 1 构建中扩增而得. PCR 反应所用5’
(下划线表示引入X ho I 位端引物为5’-CCG TCT AT A TTT TCT TT A GCT ACC ATG -3’
(下划线表示引点) ; 3’端引物为5’-AAA TT A AT C G AT GT A CAG CT C GT C CAT GCC G AG AGT G A -3’
入C la I 位点) . -GFP -A t A GP17载体pB I 121-SS t om [7]
野生型拟南芥基因组DNA 作为模版用于PCR 扩增A t A GP19的编码区. A t A GP19编码区的5’端引物
(下划线表示引入C la I 位点) ; 3’为5’-G AC TGC A TC G A T GT A AAT GCA CAA GG A CCT GCT GCT -3’
(下划线表示引入端引物为5’-GGC T T AG GCT GT C AT A GCA AGT AG A AAG AGG A -3’
X ba I 位点) .
将所得PCR 产物顺序导入表达载体pK ANN I B AL
1. 2. 2 电击转化农杆菌[9], 再将含有35S Ca MV 启动子和GFP -A t A GP19融[10]合蛋白的片段从表达载体pK ANN I B AL 插入双元载体pART27.
利用B i o -Rad 的GENE P ULSER II 系统将以上克隆所得的双元载体pART27-电击转化导入根癌农
-1-1杆菌(A grobacterium tum efaciens ) 菌株LBA4404. 随后, 农杆菌在含有25μg ・mL 卡那霉素和25μg ・mL
链霉素的LB 固体培养基上进行筛选. 阳性农杆菌克隆由PCR 进一步确证后用来介导转化烟草BY -2悬浮细胞[11].
[6, 12, 13]1. 2. 3 农杆菌介导转化烟草BY -2悬浮细胞PCR 验证后, 阳性农杆菌克隆用于介导转化BY -2悬浮细胞培养
-1, 以获得表达外源融合蛋白-1的转基因细胞体系. 转化后将细胞平铺于含有100μg ・mL 卡那霉素和300μg ・mL ti m etin 的NT -1
固体培养基上, 在暗处进行筛选.
-1一个月后, 将具双抗性的BY -2细胞的小愈伤组织转移到含有100μg ・mL 卡那霉素和300μg ・
-1mL ti m etin 的SH (Schenk and H ildebrandt ) 液体培养基中, 继续暗培养. 之后转基因悬浮细胞培养于仅含100μg ・mL 卡那霉素的SH 液体培养基中, 每2～3周继代一次.
PCR 检测出外源35S Ca MV -GFP -A t A GP19片段已插入抗性的BY -2细胞基因组中. 紫外灯选择荧-1光最强的细胞, 进行培养用于显微镜观察.
第5期杨捷, 等:
拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白的亚细胞定位・7
55・
1. 2. 4 利用激光共聚焦扫描显微镜对融合蛋白进行亚细胞定位
用带GFP 滤镜的激光共聚焦扫描荧光显微镜(LS M510, Zeiss ) 观察稳定高效表达GFP -A t A GP19融合蛋白的烟草BY -2悬浮细胞, 激发光波长为488n m. 为观察质壁分离后细胞内荧光分布情况, 4%氯化钠溶液处理BY -2细胞, 15m in 后于显微镜下观察. 所获图像由Zeiss LS M i m age br owser 处理. 使用野生型BY -2细胞作为对照.
2 结果与讨论
2. 1 A t AGP19蛋白生物信息学分析
A t A GP19蛋白长度为248个氨基酸. 通过生物信息学分析, 类似其三个同源蛋白Le AGP1、A t A GP17和A t A GP18, A t A GP19也有一个N -端信号肽区域, 一个富含Hyp 、A la 、Ser 、Thr 的AGP 蛋白特征区域和一个C -端疏水区; 其中N -端信号肽区域引导蛋白分泌到细胞表面, AGP 特征区域包含一个富含赖氨酸的亚区域, 而C -端疏水区会在蛋白合成后被GP I 锚取代, 从而将AGP 蛋白锚定到细胞膜外表面(图1) . 对Le AGP1、A t A GP17和A t A GP18蛋白的定位研究已直接或间接地表明这些蛋白通过其GP I 锚分布在细胞膜外表面[5-8]
.
图1 A t A GP19的c DNA 及蛋白序列
(下划线:信号肽序列; 粗体:富含赖氨酸区域; 斜体:GP I 锚添加点)
Fig . 1 CDS and a m ino acid sequences of A t A GP19
(underlined:signal pep tide; bold:Lys -rich regi on; italic:GP I anchor additi on site )
・756・
2. 2 融合表达载体的构建福州大学学报(自然科学版) 第38卷
为准确定位A t A GP19, 构建了GFP -A t A GP19融合蛋白载体, 利用基因工程技术使其在烟草BY -2细胞中表达. 由于GFP 插在信号序列及A t A GP19编码区之间, 因此不会影响C -端GP I 锚的添加(图2)
.
图2 GFP -A t A GP19融合基因的结构
Fig . 2 Genetic organizati on of the GFP -A t A GP19fusi on construct
2. 3 对融合蛋白进行亚细胞定位观察
在转基因的BY -2细胞中, 观察到绿色荧光分布在细胞表面(图3) . 为了区分细胞膜及细胞壁, 用NaCl 诱导BY -2细胞进行质壁分离. 在被诱导质壁分离的细胞中, 绿色荧光聚集在细胞膜而非细胞壁上. 除了细胞膜, 荧光还集中在Hechtian strands 中. Hechtian strands 是细胞膜和细胞壁之间的粘合点(图
4) . 因为野生型BY -2细胞无背景荧光, 因此转基因BY -2-A t A GP19融合蛋白产生, 并且荧光的位置体现了细胞内A t
A GP19图3 荧光分布在表达GFP -A t A GP19融合蛋白
的转基因BY -2细胞表面
(C W:细胞壁; P M:细胞膜)
Fig . 3 GFP fluorescence was observed on the cell surfaces
of transgenic BY -2cells ex p ressing a GFP -A t A GP19
fusi on p r otein
(C W:cell wall; P M:p las ma me mbrane ) 图4 在质壁分离的转基因BY -2细胞中, 绿色荧光集中在细胞膜和Hechtian strands 上(C W:细胞壁; P M:细胞膜; H:Hechtian strands ) Fig . 4 The GFP -A t A GP19fusi on p r otein was l ocalized of t o the p las ma me mbrane and Hechtian strands p las molyzed BY -2cells . (C W:cell wall; P M:p las ma me mbrane;
H:Hechtian strands )
已证实, 在表达外源不含C -端疏水区的Le AGP1蛋白的BY -2细胞中, GFP 并非特异性地分布在细胞膜上, 而是分布在细胞膜与细胞壁之间, 并且被大量分泌到培养基中[5]. 因此推断, A t A GP19是通过其蛋白C -端的GP I 锚连接到细胞膜上的.
除了A t A GP19之外, 其他三个Lys -rich AGPs, 即Le AGP1、A t A GP17和A t A GP18都定位于细胞膜上, 并且已通过生化手段证实了Le AGP1中GP I 锚的存在. 本文描述的GFP -A t A GP19融合蛋白在转基因BY -2细胞中的荧光分布模式同另外三个Lys -rich AGPs 相同. 综上, 本研究表明A t A GP19分布在细胞膜上和Hechtian strands 中, 而A t A GP19在细胞膜上分布, 推测是通过其GP I 锚的固定. [5-8][5]3 结语
通过对A t A GP19的亚细胞定位, 为该蛋白在细胞膜上的定位提供了实验依据,
并为阐明其生物功能
第5期杨捷, 等:拟南芥中一个经典阿拉伯半乳糖蛋白的亚细胞定位・7
57・奠定基础. A t A GP19可能在拟南芥植物细胞表面发挥作用, 参与细胞水平上的信号传导. 参考文献:
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(责任编辑:杨青)