L-赖氨酸的故事:从代谢途径到工业生产

L-赖氨酸的故事：从代谢途径到工业生产

1 导言

2 赖氨酸合成途径

3作为生产菌的谷氨酸棒杆菌

3.1 赖氨酸的合成

3.2中心碳代谢

3.3最大赖氨酸生产能力

4菌种工程

4.1经典工程

4.2赖氨酸合成的代谢工程

4.3 NADPH的代谢工程

4.4前体物质代谢工程

4.5通过系统生物方法的菌种工程

5工业生产过程

5.1大规模生产

5.2工艺优化

摘要

L-赖氨酸是一种动物和人类所必需的氨基酸，它在很多食品和饲料中是存在的，但是在很多情况下，高纯度的赖氨酸是被添加到饲料中的。随着对赖氨酸生化调控途径的研究以及微生物高产氨基酸能力的研究，在营养需求上，赖氨酸的重要性越来越突出。一个重要的里程碑是在1956年从土壤微生物中分离得到的谷氨酸棒杆菌能够生产谷氨酸，并很快被用于生产TCA循环产生的另一种氨基酸：赖氨酸，第一次获得了赖氨酸生产菌株。 在发现赖氨酸生产菌后的50年内，对该菌的生理特性的了解得到很大的发展，并对工业生产菌株进行了开发和优化。目前，生物技术在生产过程中的使用，使赖氨酸的年产量大约在750000吨左右。 今天，面向系统的方法，旨在研究细胞不同组成部分如转录子，磁通量子和代谢组分的联系，提供了一个新的强大的平台，将推动更全面的理解和研究赖氨酸高产微生物，得到更优越的生产菌株。

1导言

作为动物饲料添加剂，L-赖氨酸是最重要的必需氨基酸之一。 动物饲料，通常是基于玉米，小麦或大麦，但是它们赖氨酸含量是非常低的。丰富的赖氨酸添加到饲料中可以更好的促进猪、鸡等畜类的生长。在此之外，直接添加赖氨酸被证明是非常有用的，它不会导致超出他们需要的其它氨基酸额外的吸收和代谢，可以避免多余的氨的形成以及在肥料中因氮含量的增加所形成的环境负担。在过去20年，全世界不同的国家持续的白肉消费量的增加，导致赖氨酸市场的急速增大（图1）。目前，全球范围的每年赖氨酸生产量为75.00万吨， 预计明年产量将增长约8％。因为只有左旋异构体的赖氨酸作为饲料添加剂是有效的，所有的制造过程将采用发酵法进行生产。 赖氨酸的生物技术的摇篮坐落在日本，氨基酸需求量的增加，特别是谷氨酸，大约在50年前的1956年日本出现了大量的菌种筛选程序，导致了生产谷氨酸的微生物谷氨酸棒杆菌的发现。几年之内，筛选得到了第一个生产赖氨酸的突变菌株，而且在大规模生产中得到推广应用。 自那时以来，生产菌的发酵流程得到了不断的优化，导致赖氨酸的生产效率，包括生产赖氨酸所需的可再生资源， 得到了很有效的提高。

图1不断发展的世界各地每年通过生物技术生产的L -赖氨酸的量

2赖氨酸合成途径

在微生物中赖氨酸的合成具有两个完全不同的路线：一个是从酮戊二酸或乙酰辅酶A开始的通过α- 氨基已二酸的途径，另一个是从天冬氨酸开始的通过二氨基庚二酸的途径。其中α- 氨基已二酸途径多发生在高等真菌，古细菌以及细菌中，分别由以下 5个酶：高异柠檬酸盐合成酶，高乌头酸合酶/顺高乌头

酸酶，异柠檬酸脱氢酶，α- 酮戊二酸和乙酰辅酶A催化生成α-氨基已二酸，再经过α-氨基已二酸还原酶，酵母氨酸还原酶和酵母氨酸脱氢酶催化生成赖氨酸。这一途径中首次是在嗜热链球菌中发现，α-氨基已二酸转化生成赖氨酸经过乙酰中间体：N2 -乙酰-L-α-氨基已二酸，N2 -乙酰- L–氨基-δ-磷酸盐，N2 -乙酰- L–氨基半醛和N2 -乙酰- L-赖氨酸，这些中间体的编码基因分别为：lysX，lysZ，lysY，要么lysJ或argD ， 要么 lysK或argF 。

在细菌和植物中，赖氨酸是由天冬氨酸通过二氨基庚二酸途径合成的。该途径不同于常见的中间物四氢吡啶羧化酶（如图2所示），这些途径包括琥珀酰中间体，而乙酰化酶途径包括乙酰化中间体和所谓的脱氢激酶途径直接从四氢吡啶羧化酶形成DL-二氨基庚二酸。最近研究发现在衣原体中存在转氨酶途径，首先从四氢吡啶羧化酶形成LL-二氨基庚二酸，然后再转化为DL-二氨基庚二酸。大多数细菌只包括这些途径之一。 但是琥珀酰途径在革兰阴性和革兰氏阳性菌中都存在，而乙酰化酶途径只在芽孢杆菌种存在。只有在少数生物中如棒状杆菌和浸麻芽孢杆菌属中两个途径是可以共存的。两个不同代谢途径的共同点在于均受到天冬氨酸激酶的反馈抑制调节。在谷氨酸棒杆菌中，天冬氨酸激酶有一个同功酶存在，它由两个基因：lysCα和lysCβ 编码，这两个基因是该酶的两个亚基的编码基因。赖氨酸和苏氨酸对该酶的生化活性具有反馈抑制作用，这个酶在芽孢杆菌中存在相同的反馈抑制作用，但是却存在两种不同的同功酶。目前存在的同功酶受赖氨酸和蛋氨酸的抑制作用，但是另外一个同功酶仅仅受苏氨酸的抑制作用。此外，在有些细菌如大肠杆菌和芽孢杆菌中，酶的活性调控代谢物在赖氨酸合成途径中还具有转录调控作用。

3 作为生产菌的谷氨酸棒状杆菌

谷氨酸棒状杆菌，包括其亚种黄色短杆菌亚种，乳糖短杆菌，钝齿棒状杆菌和分枝短杆菌，是赖氨酸工业生产中最重要的微生物。其他物种唯一在赖氨酸生产中使用的是重组的大肠杆菌菌株。20世纪50年代发现谷氨酸棒杆菌具有分泌氨基酸的功能是，该菌是革兰氏阳性，棒状，非活动，好氧菌（图3）。

图2二氨基庚酸途径和在原核生物中从天冬氨酸开始的赖氨酸的合成途径 ：琥珀酰途径（A）;乙酰途径（ B），脱氢酶途径（C），和转氨酶途径（D）

图3谷氨酸棒状杆菌 ATCC 13032电镜图

更详细的特点包括细胞壁上具有细胞壁半乳聚糖和具有26-36个碳原子组成的霉菌酸和通过中间交叉连接的胞壁质囊酸聚糖，基因组的GC含量为53.8％。进一步的生化研究，如最近的谷氨酸棒杆菌手册，它综述了过去几十年谷氨酸棒杆菌的研究和最近测序得到的基因组序列，使我们对赖氨酸的生物合成和代谢反应有了更详细的了解（图4）。

图4 中央代谢途径和在谷氨酸棒状杆菌中赖氨酸的合成途径

3.1赖氨酸合成

赖氨酸属于天冬氨酸族氨基酸，在谷氨酸棒杆菌中是从丙酮酸，草酰乙酸和二个氨分子（供应生成还原型辅酶Ⅱ来增加能量）开始合成的。有趣的是，机体有一个赖氨酸合成分枝途径。这个分支途径增加了改变谷氨酸棒杆菌环境条件的复杂性，例如氨含量的改变。 DL-二氨基庚二酸作为赖氨酸途径的中间代谢物是胞壁质囊合成必不可少的组成部分。赖氨酸生物合成的调节物天冬氨酸激酶，是

催化天冬氨酸磷酸化的关键酶，该酶受赖氨酸和苏氨酸反馈调节。赖氨酸合成中辅助因子的形成与中央新陈代谢是密切相关的。 赖氨酸在合成过程中涉及的酶总结见表1。

3.2中央碳代谢

赖氨酸工业生产中最重要的底物是淀粉和糖蜜。它们是基于葡萄糖，果糖和蔗糖为主要碳来源的，这些化合物通过磷酸烯醇式丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统来吸收。 碳源的选择决定谷氨酸棒杆菌在合成赖氨酸过程进入中心代谢的入口，最早在谷氨酸棒杆菌中鉴定得到的中心代谢网络包括糖酵解途径，磷酸戊糖途径，三羧酸循环（TCA）和乙醛酸循环，而恩特纳-杜德洛夫途径还没有被发现。磷酸戊糖途径中的氧化部分包括氧化还原型辅酶Ⅱ依赖性酶葡萄糖6磷酸脱氢酶和6 磷酸葡萄糖脱氢酶激酶。 对这两种酶的动力学特性有更深入的研究。 谷氨酸棒杆菌代谢途径涉及到C4代谢的TCA循环和C3代谢的糖酵解途径（图4）。 该途径中具有补充TCA循环的丙酮酸羧化酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶，苹果酸酶，磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，草酰乙酸脱羧酶，磷酸烯醇式丙酮酸合成酶，其中草酰乙酸脱羧酶和磷酸烯醇式丙酮酸合成酶的编码基因还没有找到，这两个酶催化从TCA循环到糖酵解的脱羧反应。在特定的情况下，由苹果酸酶供应的还原型辅酶Ⅱ可以促进菌的生长。 然而，苹果酶的删除并不影响以葡萄糖或谷氨酸酯为营养元素的谷氨酸棒杆菌的增长，表明有还原型辅酶Ⅱ参与的代谢途径是非常复杂的，有人推断，丙酮酸之间的酶/磷酸和苹果酸/草酰乙酸循环合作参与了过剩ATP的再生。

除了中央分解途径，合成代谢途径也有了更深入的研究，它可以提供更详细的关于细胞的组成和前体物质的增长需求的信息。约16.4 mmol还原型辅酶Ⅱ 是生物量合成所必需的。很明显，还原型辅酶Ⅱ的合成与赖氨酸合成是相互竞争的。 在好氧条件下每合成0.5克（干物质/葡萄糖）生物产量需要至少合成1.7摩尔还原型辅酶Ⅱ（摩尔葡萄糖），来促进磷酸戊糖途径和TCA循环的运行。 应当指出有关代谢网络的知识正在不断增加， 例如作为补缺酶的丙酮酸羧化酶的鉴定，特殊底物如蔗糖在菌的生长中所产生的一些新的反应。

3.3最大赖氨酸生产能力

谷氨酸棒杆菌生产谷氨酸的最大能力，即理论上的最高产量是一个重要的特点，因为它提供一个正在运行的工业程序和流程所剩余的优化潜力，提供建议或遗传工程。之前的化学度量计算只考虑所涉及到的赖氨酸代谢的主要途径，生产

上理论推断得到最大75％的葡萄糖摩尔赖氨酸产量。通过计量网络分析对代谢途径有了更详细的了解，它可以考虑到在中央代谢途径中全部可用的代谢，包括不同反应可逆或不可逆信息以及额外的补充和限制造成的代谢网络。 这种方法被命名为初级流量模式分析，最近已应用于计算谷氨酸棒杆菌生产蛋氨酸的能力。 这种分析方法得到的谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸的最大理论产量为82％（图

5）。硅片通路分析还提供了关于这一理论的最佳的生化反应信息，即相应的理论代谢通量分布。 最佳的基本流量模式，即最大赖氨酸产量，磷酸戊糖和苹果酸酶所提供还原型辅酶Ⅱ的最佳量在（图5）中有详细的说明。 丙酮酸羧化酶，苹果酸脱氢酶和苹果酸酶形成一个像转氢酶的循环促使NADH 转化为还原型辅酶Ⅱ， 从而提供额外大量的重要的辅助因子。这种代谢周期不同于以前描述的涉及到PCx，PCK，和MDH的体外循环途径。除了可溶性苹果酸脱氢酶，谷氨酸棒杆菌还有其他的促进草酰乙酸转化为苹果酸的酶：膜结合的苹果/醌氧化还原酶。 这两个酶在体内的催化反应可能是循环的， 从而导致NADH进行氧化还原反应。 赖氨酸合成途径中脱氢酶分支是赖氨酸合成的唯一途径，这意味着通过TCA循环的通量为零，也没有生物量的形成，这是很难以实现。 生产上的最佳生产率可以比理论最大值低一些，但是仍然大大要高于目前实践所取得的收益（大约55％的范围）。

4菌种工程

在发现它有生产和排泄氨基酸的能力之后，谷氨酸棒杆菌被用于建立一个能生产几个氨基酸的生化生产程序。多年来各种菌种工程方法已被开发用来建立更加有效的生产菌株。

4.1经典工程

在谷氨酸棒杆菌被发现之后，通过对它进行反复的随机突变（紫外线或化学诱变）和选育才得到了第一个生产氨基酸菌株。在这些试验中成功的关键是使用有毒的赖氨酸类似物，如S -（2 -乙基）半胱氨酸，来筛选具有耐药性的菌株。 后来发现所有这些菌株在天冬氨酸激酶基因上有点突变，使该基因编码的酶（受赖氨酸和苏氨酸反馈抑制）被释放。这是该菌可以进行赖氨酸生产的最重要的特

图5 最大赖氨酸产量的谷氨酸棒状杆菌代谢流量分布

征，后来还发展成可以减弱甚至阻止苏氨酸的生物合成，即营养缺陷型菌株。 通过进一步的诱变和选育，获得其他氨基酸，维生素或抵抗不同抗代谢物得营养缺陷型菌株。随后的突变体逐步得到改善，获得具有显著的生产特点如转化率达50％和赖氨酸盐酸生产性能效价高于100的衍生株。在菌种发展过程中，额外的营养需要和弱胁迫导致大量的不需要的突变株产生，但是这些不利的菌株促进菌株优化程序中更具有目的性的方法产生。 通过目标基因来改善赖氨酸生产已确定（见下文），这就有可能通过引入从野生型菌株中分离获得的突变的等位基因来建立没有额外的营养需求的稳定的或耐胁迫的赖氨酸生产菌。

4.2代谢工程的赖氨酸合成

随着分子生物学和基因工程手段的开展，可以通过对针对性的基因进行修

改， 实现谷氨酸棒杆菌更合理的优化。 从逻辑上讲，这些研究很多都集中在通过直接修饰赖氨酸合成途径中的酶来优化流量分布（图5）。天冬氨酸激酶，二氢吡啶二羧酸合成酶和赖氨酸运出酶这三个酶的修改，对于赖氨酸产量的提高具有很大的影响（图6）。 天冬氨酸激酶是赖氨酸代谢控制途径中的关键酶，它受苏氨酸和赖氨酸的反馈抑制。lysC基因β-亚基编码区的不同点突变，可以释放反馈控制的酶， 并导致形成赖氨酸的产量增加。同样，天冬氨酸激酶基因lysC的过表达也可以刺激生产。今天，具有反馈控制释放的天冬氨酸激酶被认为是工业赖氨酸生产菌的重要特点。 这被认为是不同的模型具有不同的氨基酸含量变化（表1）。质粒编码的dapA基因的过表达显着增加赖氨酸，该基因表达量的

图6在谷氨酸棒状杆菌中赖氨酸生物合成途径。

扩增通过对广泛的启动子序列突变进一步得到实现，即发现了一个热点：- 10区域。 琥珀酰分支的两个酶二氢吡啶二羧酸异构酶与琥珀酰氨基庚二酸转氨酶的过表达，有利于赖氨酸的形成。赖氨酸生产中的惊人发现是赖氨酸运出酶的发现和随后的过表达导致赖氨酸分泌速率的增加。谷氨酸棒杆菌中的lysE基因在赖氨酸生产菌中的表达证明它可以使赖氨酸生成甲醇。 总之，高效赖氨酸生产中赖氨酸途径的工程酶的重要性再次被事实所证明， 即今天的赖氨酸生物合成途径的每一个基因都覆盖着该领域的一个或几个专利（表1）。

4.3 NADPH的代谢工程

还原型辅酶Ⅱ是赖氨酸的生物合成途径中直接或间接地通过氨的吸收来供应的，它的供应是赖氨酸高产的关键。谷氨酸棒杆菌中NADPH的代谢途径是通过对不同生理条件下 13C代谢流分布的研究获得的，这使得建立了一个还原型辅酶Ⅱ的平衡。在谷氨酸棒杆菌中，葡萄糖6磷酸脱氢酶，6磷酸葡萄糖脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶以NADP为辅酶，并催化NADPH的产生反应。16.4 mmol NADPH消耗反应包括赖氨酸生产和增长。 图7a说明了还原型辅酶Ⅱ在谷氨酸棒杆菌中的代谢是高度灵活的适应给定的细胞的整体生理需要的。还原型辅酶Ⅱ的供应和消费变化是由生理增长的态势，应用的碳源或遗传背景所决定的。 在大多数情况下，还原型辅酶Ⅱ显然是过剩的，这似乎是随着还原型辅酶Ⅱ氧化减少而造成的。在特定的情况下，还原型辅酶Ⅱ的局限性是明显被观察到。 例如以果糖为底物的伴随少量的PPP流量的分批培养或生产的最大赖氨酸生产。

还原型辅酶Ⅱ供应和需求的不平衡性表明在谷氨酸棒杆菌体内，存在未被检测到的具有活性的供应或需求NADPH的代谢反应。还原型辅酶Ⅱ的消耗可能包括呼吸链中超氧化物产生的NADPH氧化酶或丙酮酸节点周围的循环代谢如之前假设的苹果酸酶。目前还没有获得清除的实验证据来支持任何一方的作用。 但是，对于四氢化酶一样的循环，包括丙酮酸羧化酶，苹果酸脱氢酶，和PEP羧化酶，删除pckA 基因可以提高赖氨酸生产，而过表达pckA基因则降低赖氨酸制品，说明这个基因的变化改变了四氢化酶循环的代谢流量分布。至于还原型辅酶Ⅱ的供应，以果糖为碳源促进菌的生长实验证明苹果酸酶对生成NADPH的贡献最大，在此条件小细胞具有很低的PPP流量，因为通过一个不利入口点进入了中央代谢，而这可能激活苹果酸酶。 然而，苹果酸酶基因malE在生产赖氨酸菌株中的过表达却并不提高赖氨酸的产量，无论以果糖，还是葡萄糖或蔗糖为碳源。

随着赖氨酸产量的增加，未分配的还原型辅酶Ⅱ消费通量变得很小（图7A），甚至明显的缺乏，生产的赖氨酸看来可能受还原型辅酶Ⅱ的限制。这是一个很简单的事实：合成四个还原型辅酶Ⅱ需要一个赖氨酸。这促进了对谷氨酸棒杆菌中还原型辅酶Ⅱ供应代谢工程的研究。NADPH代谢工程成功的一个先决条件是对通过不同的方法对还原型辅酶Ⅱ代谢供应的主要途径的鉴定。在90年代初

图7在谷氨酸棒杆菌不同栽培品种还原型辅酶Ⅱ的代谢

对赖氨酸代谢网络的计量调查已，赖氨酸产量的增加与ppp流量的增加和TCA循环流量的减少有密切的关系。后来的代谢通量分析和遗传实验证明了ppp在赖氨酸产量增加中的重要性。对不同菌株在不同条件下不同流量的研究，得出PPP流量与赖氨酸产量关系的研究结果见图7B。 通过对理论流量分布和最优生产的研究发现， PPP对于有效的赖氨酸生产的重要性变得非常明显（图5）。 与PPP相比，随着赖氨酸产量的增加，异柠檬酸脱氢酶逐渐减少。总之，研究结果表明

（1）赖氨酸产量可能被供应的还原型辅酶Ⅱ所限制；（2）PPP是供应NADPH的主要途径。 鉴于这种情况，为了提高赖氨酸的产量，采用了不同的方法来达到疏导PPP通量的目的。 例如，删除了磷酸葡萄糖异构酶基因pgi，迫使细胞通过PPP代谢葡萄糖底物，使赖氨酸生产得到增加。 然而这种策略似乎只适用于

以葡萄糖为底物的程序，因为以蔗糖为底物的过程需要有活性的磷酸葡萄糖异构酶来使碳循环进入PPP来供应全部的还原型辅酶Ⅱ。在谷氨酸棒杆菌（在lysC基因上有一个点突变）中扩增表达果糖1,6 –二磷酸酶基因fbp，并在葡萄糖，果糖和蔗糖为底物的条件下进行生产，发现赖氨酸产量最多可提到到40％。对突变株的分析表明果糖1,6二磷酸酶基因的过表达使得PPP的流量增加了10％。 另一方面，对具有lysC，hom，pyc，zwf四个基因点突变的突变菌株过表达fbp基因，同样提高了赖氨酸产量，因为细胞内果糖1,6二磷酸浓度降低，它在蔗糖工程菌中是葡萄糖6磷酸和6磷酸葡萄糖的抑制剂。 这些差异很可能是由菌种背景的不同造成的，例如过表达fbp基因的菌株具有ppp疏通能力。 更成功的例子包括对ppp基因进行点突变，该基因序列是以野生型谷氨酸棒杆菌和传统的衍生工程菌的相应序列为基础鉴定得到的。编码葡萄糖6磷酸脱氢酶的zwf基因 A243T和编码磷酸葡萄糖脱氢酶的gnd基因T1083C的点突变都导致赖氨酸滴度显着增加。6磷酸葡萄糖脱氢酶的修改使ppp流量增加了8％，这可能是酶的正向动力学变化造成的。

4.4供应代谢工程的前体物

草酰乙酸是天冬氨酸族氨基酸的直接前体物，包括赖氨酸。在谷氨酸棒杆菌中，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶和丙酮酸羧化酶参与供应草酰乙酸的反应。通过13C代谢流量分析不同条件下所有添补的净羧化作用流量和进入到赖氨酸生物合成途径的流量的相关性，证明这些酶对于赖氨酸生产的重要性变得越来越明显（图

8）。 丙酮酸羧化酶在谷氨酸棒杆菌中被认为是主要的添补酶，编码基因的过表达可以提高赖氨酸生产。这也是有道理的，因为具有糖吸收功能的磷酸转移酶系统的存在，使得谷氨酸棒杆菌在生长阶段产生大量的丙酮酸。但是，丙酮酸羧化酶基因pyc的删除导致菌在以乳酸为唯一碳源条件下无法生长，而过表达pyc基因却使能产生赖氨酸的菌体量大大增加。了解了丙酮酸羧化酶在赖氨酸生产中的重要性，点突变C1372T系统衍生菌，并引入pyc基因，大大的提高了赖氨酸生产。然而，应当指出的是，磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因ppc的过表达有利于天冬氨酸家族氨基酸的形成。

图8通过13C代谢流量分析不同条件下所有添补的净羧化作用流量和进入到赖氨酸生物合成途径的流量的相关性

在谷氨酸棒杆菌中，通过遗传，生化和13C代谢流量分析方法对丙酮酸节点周围的代谢进行的研究证明了使C4代谢的TCA循环进入到C3代谢的糖酵解所需要的脱羧酶的存在。 这些酶，包括磷脂烯醇式丙酮酸羧化酶和苹果酸酶，除了具有羧化作用， 还建立了一个高度灵活的围绕丙酮酸节点的代谢循环反应，这在其他各种微生物也是存在的，它可能的功能是在一定条件下消耗过剩的ATP或平衡细胞内的丙酮酸节点周围代谢池的大小。 此外，还存在对还原型辅酶Ⅱ代谢有贡献的假说。 鉴于这些研究结果，编码脱羧酶的基因的删除成为提高添补净流量的战略手段。 事实上，删除磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶基因 pckA显着改善了赖氨酸产量。但是，无论是删除还是过表达苹果酸酶基因，都显著的影响了谷氨酸棒杆菌以果糖为碳源的代谢；而苹果酸酶基因的过表达并没有改变谷氨酸棒杆菌生产赖氨酸的量，这可能是由于这样的事实：典型的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶催化主要的羧化反应，而苹果酸酶显然只是一个小角色。 然而，在某些不同的生理条件下，它并不能被排除。

4.5通过系统生物学方法的菌种工程

过去的实验清楚地表明，有关生理代谢的详细定量知识需要设计更合理精良的生产菌株。特别是用于生产氨基酸的谷氨酸棒杆菌，具有中央代谢和氨基酸

的生物合成途径密切联系的特点，更全面的理解代谢调控途径被证明是至关重要的。 可用的强大的实验和计算工具使对工业生产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的代谢途径有了更详细的定量研究。这方面研究的里程碑是谷氨酸棒杆菌基因组序列的测定以及基因遗传库的研究。通过DNA微阵列对转录组的研究提供了不同条件下基因表达量的变化，例如在不同碳源葡萄糖或醋酸下菌的生长或赖氨酸产量。同样，基于二维凝胶电泳的蛋白质组分析已经证明了了解主要的代谢途径（例如氮饥饿）的重要性。代谢通量量化对我们目前了解的谷氨酸棒杆菌的代谢的巨大贡献前面已经指出。为此目的，更全面的研究方法，包括13 C示踪试验，代谢平衡，以及示踪物模型已经被开发并应用于谷氨酸棒杆菌的研究。必须提到的重要的研究是在谷氨酸和赖氨酸生产中生长过程通量的分析，对不同的赖氨酸生产突变体家族，当共同利用乙酸酯和葡萄糖，工业生产赖氨酸时不同的碳源。 进一步的成就包括在小型化的通量研究，以供扩大生产规模用，为实现规模化生产提供新的分析方法和动态条件下流量分析方法。

这些工具大大促进了我们目前对谷氨酸棒杆菌代谢的理解。不过，为了充分说明一个生物系统的生理状态，不是某一个 ，而是所有的功能组（基因组，转录组，蛋白质组，代谢组，以及流量组）都必须分析到。这种系统导向的第一个例子已经揭示了巨大的潜力， 并促进了系统生物技术方法的发展。 这种方法特别适用于有目的的进行复杂调控网络的多方向改变来提高生产菌株的耐受性，如高温度，高盐量或极端的pH值。

5 工业生产过程

5.1大规模生产

今天， 很多大型工厂进行赖氨酸工业生产，饲料级氨基酸的市场主要集中在发展中国家一些供应商手中。

图9赖氨酸生产工厂，位于韩国的一个巴斯夫公司生产厂

作为一个例子，图9显示了坐落在韩国西海岸的巴斯夫公司的赖氨酸生产基地。 这家工厂的年生产能力约10万吨，占世界市场15％份额。赖氨酸的大规模工业生产可分为不同的步骤包括上游处理程序，发酵程序本身和下游的加工程序。上游加工包括原材料检验，运输和贮存，原材料的制备，以及为生产接种的准备。 赖氨酸的主要工业生产碳源为甘蔗糖蜜，甜菜糖蜜，蔗糖和葡萄糖，而后者则是通过淀粉水解获得的。 具有复杂变化的营养用于一批又一批赖氨酸生产，需要对培养基进行检测来确保原料稳定性。 碳源是赖氨酸生产的主要成本因素，因此糖的供应商和赖氨酸生产商是密切联系的，对于生产程序，糖作为最重要的成本，影响到转化率，具有很重要的经济利益。 接种的一般准备涉及到不断扩大体积的生产菌株的连续培养， 因为谷氨酸棒杆菌在生物素浓度低于0.1g/L条件下，会进入滞后生长阶段。 今天，赖氨酸生产工厂使用500立方米的大型发酵罐，更受益于规模经济。 在下游程序中产品的提取和纯化也是一项重要的成本因素。通过真空过滤，蒸发和喷雾干燥分离细胞，纯化产品的路线流程图在图9中。 此外还使用了替代战略，主要是最终获得赖氨酸而定的。在过去，赖氨酸主要是通过离子交换树脂来分离纯化的，然后加盐酸，蒸发并干燥。 这种方法形成的赖氨酸盐酸晶体比相应的硫酸盐更易吸潮。这样的过程得到的谷氨酸棒杆菌的生物量，作为公认的安全的有机体，更适合用于动物饲料。 今天，随着技术的进步和发展，使下游加工程序更加经济化，并生产得到不同的赖氨酸

产品， 例如液体赖氨酸（50％纯度），赖氨酸硫酸盐颗粒（40-50％纯度），或液体赖氨酸硫酸盐（20-30％ 纯度），这些产品今天在市场上也是存在的。 颗粒状的产品含有整个发酵液，生产该产品可降低成本和增加额外的营养价值。

5.2工艺优化

赖氨酸的生产过程优化可以显着降低生产成本。下游工艺的改善导致不同赖氨酸产品的生产就是一个很有效的例子。 其他努力的目标是在这个过程中加强对运作模式的改变。 反复分批或连续补料运行而无需反应器或准备接种是一个有趣的方法。当生产程序结束以后，一部分发酵液被遗留在反应器中并混合新鲜培养基发酵，可以大大降低停机时间，从而增加容积效率，即某一工厂的生产能力。 生产菌株的遗传并不稳定，如赖氨酸生产中产生其他氨基酸营养缺陷型突变体。 进一步的改善是将赖氨酸生产过程制作为一个持续的过程进行，但到目前还没有实现大规模生产，研究的规模也较小，如连续培养下进行赖氨酸生产时磷酸盐和碳源限制的研究，但是，这些方法具有很大的潜力。 当转换成批处理或过程的补料流程，延长运行时间时，生产菌株稳定性仍然是一个难题，但可能在不久的将来被克服通过对基因遗传不稳定相关的代谢过程研究的深入或新工具的应用，例如用流式细胞仪进行量化接种。

工艺优化或工艺过程设计可以采用流程建模来支持， 过程模型不仅要考虑不同的单元操作过程的质量和运行参数的化学计量过程，而且还考虑到节能环保方面。在这方面，过程建模需要有对过程的详细的了解，工艺效率的估计，实现最优产量的条件，产品效价，选择性识别或尽量减少环境的负担。最近有不同的例子已表现了他们对赖氨酸生产的个案研究，在这个例子中，赖氨酸生产的过程模型，如图10所示的流程图，建立和实施了一个过程建模软件。对于给定的进程设置，耦合一个简单的赖氨酸生产的生物模型，可以很好地显示程序的最低条件，使生产成本最小化，提供最大空间和时间收益率。这种模型不仅支持现有的流程，而且还可以支持最佳发展的新工厂。通过对安装过程中的改变，例如替代下游加工路线，优化配置过程等，可以在早期的发展阶段进行，可改变的自由度是很高的。

图10工艺的赖氨酸生产厂流程图。