橙皮苷酸催化水解工艺的研究_郑美瑜

60 2010, Vol. 31, No. 06

食品科学※工艺技术

橙皮苷酸催化水解工艺的研究

郑美瑜，夏其乐，邢建荣，杨 颖，陆胜民*

(浙江省农业科学院食品加工研究所，浙江 杭州 310021)

摘　　　要：目的：探讨橙皮苷在碱性有机溶剂辅助下的酸促水解及产物的初步分离，以期通过此法来制备两种水解产物橙皮素-7-葡萄糖苷和橙皮素。方法：对影响水解的主要因素：酸的种类、水解方式、酸浓度、有机溶剂的种类和水解时间进行探讨。结果：水解的较佳条件为：橙皮苷先用氢氧化钠溶液和异丙醇组成的碱性有机溶剂溶解，再在100℃条件下酸水解，盐酸浓度为1.5mol/L，水解时间为15～45min。利用混合产物中3种物质在丙酮及其水溶液中溶解性的差异来分离纯化水解产物也取得了一定的效果。结论：橙皮苷在碱性有机溶剂辅助和一定的盐酸浓度下可以得到较好地水解。

关键词：橙皮苷；酸水解；橙皮素-7-葡萄糖苷；分离

Acid-catalyzed Hydrolysis of Hesperidin

ZHENG Mei-yu，XIA Qi-le，XING Jian-rong，YANG Ying，LU Sheng-min*

(Institute of Food Processing, Zhejiang Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China)

Abstract ：To provide a method for preparing two hesperidin hydrolysates, namely hesperetin-7-glucoside and hesperetin, acid-catalyzed hydrolysis of hesperidin in an alkaline organic solvent system was explored and the resulting hesperidin hydrolysateswere preliminarily separated. Crucial factors affecting acid-catalyzed hydrolysis, such as acid kind, hydrolysis mode, acidconcentration, composition of alkaline organic solvent system and hydrolysis time were investigated. Results showed that fulldissolution of hesperidin in a mixed system of sodium hydroxide solution and isopropyl alcohol under preheating conditionfollowed by hydrolysis for 15－45 min catalyzed with 1.5 mol/L hydrochloric acid resulted in an optimal hesperidin hydrolysis.Moreover, a satisfying separation of 3 hydrolysis products obtained was achieved using their difference of dissolubility inacetone and water. Thus, some concentration of hydrochloric acid in an appropriate alkaline organic solvent medium can give agood catalysis for hesperidin hydrolysis.

Key words：hesperidin；acid-catalyzed hydrolysis；hesperetin-7-glucoside；separation

中图分类号：TS209 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)06-0060-05

橙皮苷是由橙皮素和芸香糖形成的糖苷，广泛存在于柑橘的果实中，是柑橘中一种重要的二氢黄酮[1]，是构成VP的成分，它具有明显的药理活性[2]，如维持毛细血管的通透性，降低毛细血管的脆性等作用。但是除了药用价值外，橙皮苷在其他方面的应用几乎很少，这是由于橙皮苷的水溶性很差，常温下在水中的溶解度只有20mg/L，而且脂溶性也不好，在大多数的有机溶剂中都不溶，微溶于甲醇，易溶于碱液和吡啶[3]。据Nielsen等[4]的研究报道，橙皮苷在人体内的生物利用率

收稿日期：2009-06-03

(bioavailability)低于它的脱糖基衍生物橙皮素-7-葡萄糖苷(hesperetin monoglucoside，HMG)。而且橙皮苷的脱糖基产物HMG的理化性质也有所改善，在水中的溶解度是橙皮苷的50倍以上[5]，脂溶性也增强，可以溶于醇类有机溶剂。橙皮素是橙皮苷的苷元，可以溶于大多数有机溶剂。通过橙皮苷的酸促水解可以得到上述这两种物质。目前国内外对此研究甚少，仅见Grohmann等[6]的研究报道，但是橙皮苷的水解是在高温140℃条件下进行的，橙皮苷大部分分解为橙皮素，HMG得率较低。

基金项目：浙江省重大农业科技专项(2008C02005-2)；浙江省农业科学院科技创新能力提升工程项目(2007R15Y01E01)作者简介：郑美瑜(1972—)，女，助理研究员，硕士，主要从事农副产品深加工与功能性物质的提取研究。 E-mail：[email protected]

*通信作者：陆胜民(1969—)，男，研究员，博士，主要从事农副产品深加工与综合利用研究。：

※工艺技术食品科学

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本实验将研究橙皮苷在较低温度下的酸水解，探讨可以生成较多HMG的水解工艺，并对得到的水解产物利用在丙酮及其水溶液中溶解性的差异来纯化。通过本研究，将使橙皮苷的研究进一步深入，为橙皮苷的二次加工提供科学依据，并为医药、化工、化妆品和保健品等领域提供化学中间体或原料。１1.1

材料与方法

材料、试剂与仪器

外标法得到产物中橙皮苷、橙皮素的含量，对于HMG，由于市场上还没有该标准品出售，故用HMG的峰面积来进行对比。1.4.1

无机酸种类及其H+浓度的影响

称取橙皮苷5g，以1:20(g/mL)的固液比分别加入不同浓度的盐酸和硫酸溶液，在120℃条件下保温2h，终止反应，调节水解液的pH值至5左右(该pH值条件下水解产物更容易从溶液中析出)，静置，过滤，把沉淀物烘干，称取10mg，用25mL甲醇超声溶解，再用0.45μm滤膜过滤后进行HPLC分析。1.4.2

水解方式和酸浓度的影响

称取橙皮苷5g，按两种方式水解：第一种为先加入1mol/L的NaOH溶液溶解，再加入10mL的异丙醇，预热，再分别加入5mol/L盐酸到溶液中，使盐酸浓度为1.0、1.5、2.0mol/L，然后在100℃水浴1h；另一种为按固液比1:20加入浓度为1.0、1.5、2.0、2.5mol/L盐酸，在120℃条件下水解1h。两种方式水解后，水解液调节pH值至5左右，静置，过滤，按1.4.1节中的处理方法对产物进行HPLC分析。1.4.3

有机溶剂种类的影响

称取橙皮苷5g，先加入1mol/L的NaOH溶液溶解，再分别加入10mL的甲醇、乙醇、丙酮、DFM代替异丙醇，预热，加入1.5mol/L盐酸到溶液中，水解时间为45min，水解后，水解液调节pH值至5，静置，过滤，按1.4.1节中的处理方法对产物进行HPLC分析。1.4.4

水解时间的影响

称取橙皮苷5g，先用加1mol/L的NaOH溶液溶解，再加入10mL的异丙醇，预热，加入1.5mol/L盐酸到溶液中，然后分别在沸水中水浴15、30、45、60min，冷却，水解液调节pH值至5，静置，过滤，滤渣烘干，称取10mg，按1.4.1节中的处理方法对产物进行HPLC分析。1.5

水解产物的分离提纯

橙皮苷水解产物烘干后，根据产物中橙皮苷、橙皮素和HMG在丙酮和丙酮溶液中的溶解度不同来进行分离。1.6

分解率计算公式

橙皮苷由浙江衢州天圣植物提取有限公司提供，通过HPLC测得其含量为96%。

橙皮苷、橙皮素标准品 中国药品生物制品检定所；盐酸、硫酸、氢氧化钠、异丙醇、二甲基甲酰胺(DMF)、乙醇、甲醇(均为分析纯)；甲醇(色谱级) 百灵威化学技术有限公司；超纯水为娃哈哈纯净水。

Ultimate3000高压毛细管色谱仪 美国戴安公司；LCQMS液质联用仪 美国热电公司；DK-S26水浴锅、DHG型电热恒温干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；BP211D电子天平 北京塞多利斯天平有限公司。1.21.2.1

仪器条件色谱条件[7]

色谱柱ZORBAX XDB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相为磷酸缓冲液A(pH3.1～3.5)和甲醇B，两种溶剂进行梯度洗脱，梯度为0～4.5min，30% B，4.5～8.2min，60% B，8.2～14min，20% B。流速为0.8mL/min，柱温为25℃，检测波长为280nm，进样量为2.5μL。1.2.2

质谱条件

称取10mg水解产物，用25mL甲醇超声溶解，进

样到液质联用仪中。色谱条件同上，质谱条件：质荷比扫描范围为200～800，离子源用正离子电喷雾离子源ESI，雾化器气体为N2，压力为25psi。水解产物的LC-MS分析由杭州师范大学完成。1.3

标准曲线的绘制

称取橙皮苷和橙皮素标准品10mg，用甲醇经超声溶解，并定容至25mL，制得橙皮苷和橙皮素的混合标准溶液储备液。分别移取标准溶液储备液0、2、4、6、8、10mL于10mL的容量瓶中，用甲醇定容到10mL，得到不同质量浓度的标准混合溶液。标准混合溶液经0.45μm滤膜过滤后，进行高效液相色谱分析，分别以峰面积为纵坐标，以质量浓度(g/L)为横坐标，得到其标准曲线方程。1.4

酸水解工艺

影响水解的主要因素有无机酸的种类、酸浓度、水解方式、有机溶剂的种类和水解时间5个因素进行探讨，对水解产物混合物进行高效液相色谱分析，通过

水解前样品质量×96%－水解后产物质量×产物中橙皮苷百分含量

分解率/%=——————————————————————————————×100

水解前样品质量

　　　　　　　 　

1.7数据分析

每个实验处理重复进行3次，结果数据表示为“平均值±标准差”。２2.1

结果与分析

橙皮苷水解产物的LC-MS分析

62 2010, Vol. 31, No. 06

食品科学※工艺技术

对水解混合产物进行液质联用分析，其液相色谱图和保留时间为7.85～8.0min的质谱图分别见图1、2，已知HMG和橙皮素的相对分子质量分别为464和302，而图2中两个质荷比为463.3和301.3，它们分别与HMG和橙皮素的相对分子质量差不多，把它们相减接近于一个鼠李糖分子的相对分子质量，所以7.979min的峰对应的物质是HMG。

[***********]05002500

2-HMG-7.979

6-橙皮素-12.596

1-橙皮苷-7.658

3-9.4025-11.813

7-13.563

[***********]14

时间/min

图１　　　水解产物的液相分析图谱

Fig.1 HPLC profile of hydrolyzed hesperidin with hydrochloric acid

100相对丰度/%

[1**********]0

橙皮素301.3

400HMG463.3

739.5850.5465.2713.8740.5926.9

737.6

由表1可知，两种酸随着浓度的增加，橙皮苷的分解率得到显著提高，橙皮素的含量也显著增加；从

HMG的峰面积来看，HMG的量却显著减少，因为酸浓度增加，也使HMG分解为橙皮素的速度加快。由于硫酸是二元酸，所以在相同酸浓度下，它的氢离子浓度是盐酸的一倍，但是从表1看出，在H+浓度相近的情况下，如硫酸的H+浓度为1.48、盐酸的H+浓度1.18mol/L时，水解率分别为42.8%和61.9%，盐酸催化水解率明显高于硫酸的。因此，本实验选用盐酸作为橙皮苷水解的催化剂。2.2.2

水解方式对水解效果的影响

橙皮苷的水解有两种方式：第一种是在较低温度下，并在碱性异丙醇溶液辅助下进行；第二种方式是在较高温度下单纯的酸催化水解，结果见表2。通过分析可知，第一种方式的水解，水解反应较缓和，橙皮苷的分解率较低，但是生成HMG较多，因为生成的HMG大部分没有转化为橙皮素；而第二种方式的水解，反应较剧烈，橙皮苷的分解率高，当盐酸浓度为2.5mol/L时，橙皮苷的分解率已达99.2%，但是HMG的生成量少，HMG进一步水解生成了橙皮素，而且反应在剧烈条件下产生了其他物质。因此，以第一种水解方式较适宜，产物HMG含量较高。从表中还可看出，在第一种水解方式下，盐酸的浓度在1.5mol/L条件下，HMG的含量较高。

表２　　　两种水解温度及不同盐酸浓度对橙皮苷水解的影响Table 2 Effects of temperature and hydrochloric acid concentra-tion on hesperidin hydrolysis

温度/酸浓度/℃100

(mol/L)1.01.52.01.0

120

1.52.0分解率/%68.5±7.571.3±5.777.6±7.064.8±8.494.1±7.598.8±8.0橙皮苷/%40.5±5.733.7±3.730.2±2.753.5±5.911.3±1.22.5±0.3橙皮素/%5.7±0.810.4±1.114.4±1.330.8±3.429.6±3.324.4±2.7HMG峰面积/(mAU・min)4.158±0.585.267±0.585.1443±0.412.3873±0.290.5628±0.070.2293±0.03

mAU

6008001000m/z

图２　　　ＨＭＧ对应峰的质谱图

Fig.2 MS spectrum of hesperetin-7-glucoside, one of hydrochloric

acid-catalyzed hydrolysis products of hesperidin

2.22.2.1

橙皮苷酸促水解条件的确定

不同无机酸及其浓度对水解效果的影响

由于不同的无机酸有不同的性质，如所带氢离子的个数、相对分子质量和分子结构等，在一定程度上也影响着橙皮苷酸水解的效率，故对最常见的硫酸和盐酸这两种无机酸催化橙皮苷水解进行了研究。由1.3节中的标准曲线制作得到标准曲线方程：橙皮苷为Y=0.49+61.96X，R2＝0.9994；橙皮素为Y=0.014+125.88X，R2＝0.9998，说明这两种物质的峰面积与其含量有很好的线性关系。由HPLC的峰面积和标准曲线方程即可得到这两种物质在水解产物中的含量。

表１　　　不同无机酸及其浓度对橙皮苷水解的影响

Table 1 Effects of inorganic acid kind and concentration on

hesperidin hydrolysis

名称

H+浓度/酸浓度/(mol/L)(mol/L)0.74硫酸

1.482.960.59盐酸

1.180.370.741.480.591.18

分解率/%

橙皮苷/%

橙皮素/%

HMG峰面积/(mAU・min)

2.2.3添加有机溶剂的种类对水解效果的影响

表３　　　不同有机溶剂对橙皮苷水解的影响

Table 3 Effect of other organic solvents used in this study as an

alternative to isopropyl alcohol on hesperidin hydrolysis有机溶剂异丙醇乙醇甲醇DMF丙酮

分解率/%

橙皮苷/%

橙皮素/%10.4±1.14.5±0.62.7±0.37.0±0.93.89±0.6

HMG峰面积/(mAU・min)

5.267±0.580.2136±0.030.1078±0.020.2036±0.03

24.3±2.789.5±13.442.8±5.169.0±12.170.3±8.4

48.8±7.3

48.0±6.278.1±11.7

9.3±1.43.4061±0.4119.1±2.51.1159±0.1230.6±4.00.8282±0.1116.1±2.34.2048±0.55

71.3±5.733.7±3.730.7±2.886.8±7.825.1±2.389.8±7.225.4±3.389.4±11.618.3±2.694.0±6.6

61.9±8.052.17±6.339.57±4.43.0561±0.37

※工艺技术食品科学

2010, Vol. 31, No. 0663

表3为以其他有机溶剂代替异丙醇的实验结果。由表3可知，这4种溶剂中对橙皮苷水解的辅助作用明显不如异丙醇，异丙醇在相同条件下橙皮苷的分解率在70%以上。这可以从3个原因进行解释，一是溶剂的沸点，沸点越低，则容易从溶液中挥发出来，因此不能发挥作用；二是对溶液酸度的影响，DMF全称为N,N-二甲基甲酰胺，有一个仲氨的结构，具有一定碱性，致使水解液中的有效酸度降低；三是对固体颗粒的分散作用，水解的反应体系为固液混合物，溶剂若能促进固体颗粒在液体中分散成更小的颗粒并分散均匀，则也能促进水解反应。异丙醇在这三方面相对较有优势，因此更能促进水解反应。2.2.4

水解时间对水解效果的影响

表４　　　不同水解时间对橙皮苷水解的影响

Table 4 Effect of reaction time on hesperidin hydrolysis水解时间/min分解率/%

15304560

橙皮苷/%

橙皮素/%

HMG峰面积/(mAU・min)

6.9763±0.96.602±0.598.2173±0.742.02±0.28

的丙酮溶液中其溶解度有所下降。橙皮苷在这些丙酮溶液中的溶解度均很低，说明橙皮苷难溶于丙酮溶液，这与Grohmann等[6]的研究结果相符，因此，利用3种物质在丙酮水溶液和纯丙酮中溶解度的不同来进行分离，其步骤如下：80%丙酮溶液提取2～3次(40℃水浴)→合并滤液、旋转蒸发(真空浓缩温度40℃)→无水丙酮提取→过滤→滤渣烘干→滤液旋转蒸干(温度40℃)，经两次提取后所得的滤渣的HPLC分析图谱见图3。从图中可以看出，提纯物中的主要成分为HMG，橙皮素含量很少，但还含有一定的橙皮苷，这可能如前面所提到的两者的性质接近的缘故，因此较难分开。经分析，在纯丙酮的滤液中以含橙皮素为主。通过对80%丙酮溶液溶解的滤渣进行反复提纯，可以回收残留的HMG。

[***********]150100500－50

3-HMG-7.983

mAU

68.0±8.834.1±4.44.36±0.671.3±6.429.9±2.77.70±0.774.8±6.728.5±2.610.0±0.975.5±6.426.4±2.212.1±1.1

2-橙皮苷-7.629

1-6.800

4-橙皮素-12.646

[***********]14

时间/min

从表4可以看出，随着水解时间的延长，橙皮苷逐渐被分解，HMG的峰面积先是比较高，之后降低，产物中橙皮素的含量逐渐增加，表明橙皮苷水解先是生成HMG的量比较多，随着水解的进行，生成的HMG进一步水解生成橙皮素。水解时间以15～45min为宜，水解时间较短时，则以水解生成HMG为主；较长时，一部分HMG则分解为橙皮素。因此水解时间应以所需得到的物质而定。2.3

水解混合物的分离提纯

从水解混合物的3种组分的极性大小依次为橙皮苷

３

图３　　　水解产物提纯物的高效液相分析图谱

Fig.3 HPLC profile of purified hesperidin hydrolysates

结论与讨论

通过对橙皮苷酸促水解的研究，得到橙皮苷在酸性

条件下较好的水解条件为：添加异丙醇和1mol/L氢氧化钠溶液各10mL作为碱性有机溶剂辅助水解，在100℃条件下，以1.5mol/L盐酸为酸催化剂，水解15～45min。在此条件下橙皮苷的水解率为70%以上，提纯后的产品中以含HMG为主。水解产物通过80%丙酮溶液分离后，滤渣中含橙皮苷为主，提纯后滤渣可以再次水解，实验表明，提纯后的滤渣第二次水解的分解率在60%左右，因此可以通过多次水解来提高橙皮苷的水解率。与Grohmann等[6]的研究相比，通过碱性有机溶剂的辅助作用，可以促进橙皮苷分散在酸溶液中并增加橙皮苷在酸溶液中的溶解度，因而水解能在较低温度下进行。

采用80%丙酮溶液和纯丙酮两种溶剂可以使水解产物中3种物质初步分离，但这种分离方法并不彻底，主要是因为橙皮苷和HMG两者的性质接近，在80%丙酮溶液提取的滤渣中会残留一部分HMG，在纯丙酮提取的滤渣中会残留一部分橙皮苷，所以要使3种物质较好地分开，更多地回收水解产物中的HMG组分，还需要对初步分离的三部分进一步提纯，如可用树脂柱层析进行分离，可能会有更好的提纯效果，当然这还有待于

＞HMG＞橙皮素，HMG的极性介于两者之间，但是它在高效液相分析图谱的保留时间和橙皮苷的很接近，相差时间仅为0.3s(图1)，因此它的极性更接近于橙皮苷。常温下橙皮苷和橙皮素在两种丙酮溶液中的溶解度，结果见表5。

表５　　　橙皮苷和橙皮素在两种丙酮溶液中的溶解度

Table 5 Solubility of hesperidin and hesperetin in different

concentrations of aqueous acetone

溶解度橙皮苷(%，m/V)橙皮素(%，m/V)

丙酮体积分数/%600.063.95

800.057.79

900.028.54

1000.017.81

从表5可以看出，橙皮素在80%、90%和100%的丙酮溶液中均比较易溶，且溶解度差不多，而在60%

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食品科学

[4]

※工艺技术

进一步研究。鉴于这两种水解产物的理化性质和生物利用率的改善，将拓展它们在食品、保健品方面的应用，如HMG可以用来合成高倍甜味剂二氢查耳酮[8]，另外，副产物鼠李糖也是一种很有价值的化工和医药原料。

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