基因工程的工具酶

第二章 基因工程的工具酶

第一节 用于基因工程的工具酶

一、限制性内切酶（Endonucleosase ）

（一）限制性内切酶（Endonucleosase ）的发现与分类

1） 50年代初发现细菌能将外来DNA 片段在某些专一位点上切断，从而保证其不为外来噬菌体所感染，而其自身的染色体DNA 由于被一种特殊的酶所修饰而得以保护，这种现象叫做限制－修饰，它们由三个基因位点所控制：hsd R, hsd M, hsd S, 十年后，人们搞清了细菌的限制与修饰分子机理：

hsd R---限制性内切酶

hsd M---限制性甲基化酶

hsd S---控制两个系统的表达

1968年Smith 等人从流感嗜血杆菌株中分离出两个类内切酶，Hind II和Hind III，为基因工程技术的诞生奠定了基础。

截止到目前为止，已经分离出400余种II 类酶，搞清识别位点的有300种，商品化的约有一百种，而实验室常用的有二十种 。

2）限制性核酸内切酶可分为三大类：

I 类 能识别专一的核苷酸顺序，并在识别点附近切割双链，但切割序列没有专一性。 II 类 识别位点（回文序列）严格专一，并在识别位点内将双链切断

III 类 识别位点严格专一（不是回文序列），但切点不专一，往往不在识别位点内部。 因此在基因工程中具有实用价值的是II 类限制性内切酶。

（二）II 类限制性内切酶的命名及特性

命名原则：取属名的第一个字母大写，取种名的前两个字母小写，构成基本名称。该种中发现的不同的酶按照顺序编号I, II, III等。如存在变种和品系，取变种或品系的一个字母。若酶存在于质粒上，则需大写字母表示非染色体遗传因子。

如，HindIII 从Haemophilus Influenzue d株中分离的第三个酶。EcoRI 表示基因位于Escherichia coli中的抗药性R 质粒上。

（三）II 类限制性内切酶的底物识别顺序及切割位点

绝大多数的II 类限制性内切酶在底物DNA 上的识别顺序长度为4，5，6碱基对，这些碱基对的顺序呈回文结构（Palindromic ），而且切点就在其内部，如EcoRI 5'-GAATTC-3' 。 DNA 被限制性内切酶切开之后，呈现两种断口：

钝端（平端）如Pvu II, Alu I, EcoR V等

粘端（粘性末端）如：EcoR I等

图2-1 限制性内切酶产生的末端

（四）识别位点在DNA 分子中的频率

对于特定的限制性酶在DNA 分子中的识别位点数目是可以计算的，四碱基的酶平均大约每256个核苷酸（44）有一个识别位点，而六碱基的酶大约4096（46）个核苷酸有一个识别序列，计算是在假定核苷酸随机排列的情况下进行的。实践中这种方法不完全正确，如λ DNA 长49kb ，对于六碱基的酶应该有12个切割位点，实际上要少一些，如Bgl II 只有6个，BamHI 只有5个，而SalI 只有2个。

二、甲基化酶

在专一位点上甲基化，与限制性内切酶相对应。

（一）大肠杆菌中的甲基化酶

dam 甲基化酶: 可在5'GATC3' 序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，这样可使一些识别顺序中含有5'GATC3' 的限制性内切酶不能切割来自大肠杆菌的DNA 如Bcl I（TGATCA ），但BamH I（GGATAA ）则不会因为N6A 的甲基化而失去活性，因为这两种酶对底物的特异性不同。

dcm 甲基化酶 此酶在序列5'CCAGG3' 或5'CCTGG3' 中的胞嘧啶C5上引入甲基，受其影响的限制性内切酶是EcoR II。

（二） 甲基化酶在基因工程中用途

许多II 类限制性内切酶，都存在着相对的甲基化酶，它们可修饰限制酶识别顺序中的第三位腺嘌呤上，封闭酶切位点，从而使其免受切割。如：M.EcoRI 催化s-腺苷-L-甲硫氨酸（SAM ）的甲基转移到EcoRI 识别顺序中的第三位腺嘌呤上，从而使DNA 免受EcoRI 的切割。

三、T4-DNA 连接酶（T4-DNA Ligase）

来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，连接修复3' 端羟基和5' 端磷酸基因，脱水形成3'-5' 磷酸二酯键

连接双链DNA 上的单链缺口（Nick ），因此亦可连接限制内切酶所产生的粘性末端 连接RNA 模板上的DNA 链缺口

连接平头双链DNA 速度很慢，在高浓度的底物和酶的作用下方可进行，这属于分子之间的连接.

图2-2 连接酶的作用方式

四、核酸酶

作用: 降解磷酸二酯键

分为：外切酶 内切酶

（一） Bal 31(来自于细菌Alteromonas espejiana) 单链特异的核酸内切酶活性，双链特异的内切酶活性。依赖于Ca2+

用途：

构建限制酶图谱

产生末端缺失突变

DNA 超螺旋线性化

（二）E. coli外切酶III

只降解DNA 分子的一条链，产生单链的DNA 分子。

（三）S1核酸酶（来源于米曲霉菌）

特性：

1. 降解单链DNA 或RNA ，降解DNA 的速度大于降解的速度

2. 降解发生的方式为内切和外切

3. 酶切活性需4.0-4.5pH 环境，Zn2+激活

4. 酶量过大时会降解双链核酸，因为双链降解活性比单链低75000倍

（四） DNase I: 来自于牛胰腺, 既可以降解单链也可以降解双链，没有特异性，产生单核苷酸或短链

五、聚合酶

（一）DNA 聚合酶I

5’-3’聚合酶活性

3’-5’外切酶活性

5’-3’外切酶活性

核酸内切酶活性

可以被枯草杆菌蛋白酶水解成：Klenow 片段和N 端具5’-

3’外切酶活性的分子。

图2-3 DNA聚合酶I

（二） Klenow酶

该酶无5'-3' 外切活性，保留了5'-3' 聚合活性及3'-5' 外切活性，基因工程中利用该酶： 修复限制性内切酶造成的5' 突出的粘性末端

标记DNA 探针

催化cDNA 第二条链的合成

末端终止法测序

图2-4 Klenow 酶的作用方式

（三） T4 DNA聚合酶

与Klenow 酶相似，外切酶活性更高。体外诱变反应中效率很高。

（四）T7 DNA聚合酶

测序酶

（五） Taq DNA聚合酶

耐高温，主要用于PCR 反应。

（六） 逆转录酶：将mRNA 转录成cDNA

AMV 逆转录酶（鸟类成髓细胞性白血病病毒）

DNA 聚合酶活性

RNase H活性

DNA 内切酶活性

核酸结合活性

M-MLV 逆转录酶（Moloney 鼠白血病病毒）

两种逆转录酶的区别

肽链的组成

禽酶2条肽链，具聚合酶和很强的RNase H活性

鼠酶1条，较弱的RNase H活性

反应的最适温度

禽酶42°C，二级结构丰富RNA ，禽酶效率高

反应的最适pH 值

禽酶pH 8.3

鼠酶pH 7.6

六、DNA 修饰酶

有大量的修饰酶，主要的有以下几种：

1） 碱性磷酸酯酶（来自于大肠杆菌或小牛肠道）可以去掉DNA 分子的5‘端的磷酸基团。

2） polynucleotide kinase: 来自于T4侵染的大肠杆菌，在5’端增加磷酸基团。

3） 末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl tansferase） 来自于小牛胸腺组织，在DNA 分子的3‘端增加一个或多个脱氧核苷酸。

4） Topoisomerase改变共价闭合双链DNA 分子的结构

第二节 DNA的切割反应

一、缓冲系统的组成

II类酶的酶活条件：Tris-HCl PH7.5, 25-50mM；10mM MgCl2 ；NaCl 0-150mM； DTT 1mM 根据不同酶对盐离子要求不同，可将缓冲液分为以下三种情况：

高盐：100-150mM

中盐：50-100mM

低盐：0-50mM

二、酶切操作

DNA 量的确定，加入酶量的确定，发应体积的确定（20μl ），反应时间的确定，1-1.5hr ，一般为37℃，但也有例外，如Taq I在65°C时活性最高。

单位限制性内切酶定义为：在最佳缓冲系统和20μl 体积中反应1小时，完全水解1μgDNA 所需的酶量。

三、酶切结果分析

（一） 酶切片段的检测

1） 通过凝胶电泳分离，根据分子量分离。根据凝胶的浓度可以分离不同分子量的片段，聚丙烯酰胺凝胶电泳可以分离1-300bp 的分子。

2） DNA分子的检测 a. 染色EB ，DNA 分子小于25ng ，很难检测到

b. 放射性自显影, 可以监测少到2ng DNA分子。

（二）估计DNA 分子的大小

根据DNA 分子的迁移率，可以用公式计算出分子量D=a-b(logM)

D 是移动的距离，M 是分子量，a, b是恒量但随着电泳条件的改变而改变。

也可以根据已知大小的片段进行比较，误差约在5%左右。

四、多酶联合酶解

对于对浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶解；

对于对浓度要求不同的酶，可以：

1. 低盐浓度的酶先切，后补加NaCL

2. 一种酶切后，换缓冲液，加5mM NaAc 0.1体积，2体积乙醇，冰浴5min ，4℃离心10min ，干燥

五、定位酶切位点

建立酶切图谱需要一系列的酶。

首先确定每一种酶切后产生的分子量和片段的数目；

然后进行双酶切；

比较酶切和双酶切的结果，绘制酶切图谱；

含糊的位点可以通过部分酶切解决，可以短时间的酶切或者在4°C条件下进行。

六、 限制性内切酶的star 活性

在PH 不合适，或甘油浓度过高≥10%时，限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。

第三节 DNA片段的连接

重组DNA 分子构建的最后一步是连接，通过连接酶完成。相对而言，钝端的连接效率较低，因此一般提高DNA 浓度的方法增加接触的机会。而粘性末端的连接效率较高，因为两个粘性末端可以通过氢键碱基互补配对。这种暂时的、碱基配对结构可以提高连接的效率。在分子克隆的连接方式主要有以下几种：

一、连接方式

（一）相同粘性末端的连接

来源:

相同的酶

同尾酶

问题:

极性有两种可能

同尾酶连接后，不能用任何一种酶酶切。称为“焊死”。

（二）平头末端的连接

粘性末端--分子内部连接，平头末端--分子间的连接。

提高连接效率的方法：

加大酶用量（10倍）

加大平头末端底物的浓度

加入10%PEG（8000），促进分子间的有效作用

加入单价阳离子， 150-200mM NaCl

提高反应温度

平头连接同样存在两种极性

（三）不同粘性末端的连接

突出5' 末端

Klenow 补平，或S1核酸酶切平，然后平头连接

突出3' 末端

T4-DNApol 切平，然后平头连接

突出末端不同

Klenow 补平，或S1核酸酶切平

连接后，可能恢复限制性位点，甚至还可能产生新的位点。XbaI 与HindIII （ XbaI恢复）， XbaI 与EcoRI （均保留），BamHI 与Bgl II（产生ClaI 位点）

（四）人工粘性末端的连接

5' 突出的末端

外源片段先用Klenow 补平；然后用TdT 补加polyC ；载体片段也用Klenow 补平，加polyG ，退火不经连接即可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。

3' 突出的末端

外源片段先用TdT 加polyG ；载体片段加polyC ；然后退火；再用Klenow 补齐；连接 平头末端

可直接用TdT 补加末端，但以加polyA/T为佳。这样稍微加热，AT 区就会出现单链区域，然后用S1核酸酶水解即可回收片段

（五）粘端与平端的连接

linker : 人工合成的、含有限制性内切酶识别序列的、短的双链DNA 片段。

– 连接的效率较高

– 酶切时可能破坏DNA 分子的完整。

adaptor ：人工合成的、具有粘性末端寡聚核苷酸。

图 2-5 linker的连接方式

（六）粘性末端的更换

在DNA 片段上某一酶切口处换成另一种酶切口

– BamHI酶切片段用Klenow 补平，或用S1酶切平；连接一段linker 或Adaptor ，使之产生EcoRI 粘性末端。这样BamHI 切口就换成了EcoRI 切口 。

– 由AluI 更换EcoRI ：AluI 切开，T4-DNApol 切平，另一段DNA EcoRI切开，Klenow 补平，连接，原来含有AluI 的片段变成含有EcoRI

二、重组率

重组率：连接反应结束后，含有外源DNA 片段的重组分子数与加入的载体分子数之比。较为理想的重组率为25-75%

提高重组率的方法：

连接反应条件 外源片段：载体＝2:1-10:1（分子数），增加碰撞机会，减少自身环化。 载体除磷 （磷酸酯酶5’除磷）。

TdT 在3’端增加人工粘性末端，防止载体自我环化 。