纤维素酶CMC糖化力测定方法的改进
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饲料研究 1999年第1期
饲料检测
纤维素酶CMC 糖化力测定方法的改进
刘国生 王 琳 李学梅 侯进怀 刘翠然河南师范大学生物系
摘要 本文研究和分析了3,5—二硝基水杨酸(DNS ) 法测定纤维素酶羧纤维素(C MC ) 糖化力的实验条件, 如:波长、温度、pH 、酶促反应时间、DNS 显色时间等。实验表明:在50℃、pH416条件下酶促反应时间5min ,DNS 显色5min , 于490nm 处测定OD 值比较适宜, 从而简化了实验操作, 便于在生产中应用。关键词 DNS 法 纤维素酶 C MC 糖化力
在饲料、食品、发酵等行业, 来越广泛, , 趋势。, , 同时纤维素酶作用的底物也比较复杂, 致使纤维素酶活力的测定方法很多, 且方法复杂而不统一。常用的方法有:CMC 糖化力法、C MC 液化力法、滤纸糖化力法、滤纸崩溃法和棉花糖化力法等。国内许多单位分别采用了以上各种方法并进行了种种修改, 使测定的方法更加多样化, 造成不同产品, 不同结果之间无法相互比较的局面。同时很多方法又不便于在生产中应用。上述测定方法中,C MC 糖化力主要代表外切β—1,4葡聚酸苷酶和内切酶的活力总和, 在研究和实际生产中应用比较普遍。因此本文主要对C MC 糖化力方法进行了实验研究, 改进了测定方法, 该方法快速而简便, 便于在饲料加工生产中进行纤维素酶活力的快速测定。1 材料和方法111 材料 纤维素酶由河南省生物工程中心提供112 试剂
11211 底物溶液:准确称取01625g 羧甲基纤维素
, 1标准葡萄糖溶液:用蒸馏水溶解2710mg 葡萄糖定容到25m L 。
11214 酶溶液:用012m ol ,pH416醋酸缓冲溶液溶
解酶制剂, 配成一定浓度的酶溶液。113 仪器 日本日立公司330分光光度计114 DNS 法测定纤维素酶活力方法参见文献[4], [7]并有改进
11411 标准曲线的绘制
取5支带有20m L 刻度的试管, 按下表量取试剂:
试管号空白值
1234
标准葡萄醋酸钠试液中葡OD 490糖溶液缓冲液萄糖量 (m L ) (012m ol Π(μL ,pH416) m ol )
[1**********]10
[**************]
[1**********]10
每管各加1m L2m ol 氢氧化钠溶液和2m LDNS 显色液, 摇匀后置于沸水浴中, 准确5min 后流水冷却,
蒸馏水定容至20m L , 摇匀后以0号管为对照于490nm 处测定各管的OD 值。以葡萄糖的μm ol 数为横坐标,OD 值为纵坐标, 绘制标准曲线。11412 C MC 糖化力测定步骤及测定条件与酶活力的关系分析
取3支带有20m L 刻度的试管,1支管作空白对照,2支管作平行样品管。每支样品管中加1m L 酶溶液, 置于50℃(酶促反应温度) 水浴锅中预热
钠盐, 溶于100m L 醋酸钠缓冲溶液(012m ol ,pH416) , 加热搅拌使之溶解。11212 3,5—二硝基水杨酸显色剂(DNS 显色剂) :称取10g3, 5—二硝基水杨酸溶于蒸馏水中, 加入20g 氢氧化钠、200g 酒石酸钾钠和500m L 水, 加热溶解后再加入重蒸酚2g 、无水亚硫酸钠015g , 待全部溶解后冷却, 定容至100m L , 贮于棕色瓶中, 放置一
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2min , 然后在3支试管中分别加入4m L 已预热至50℃的底物溶液, 准确计时5min (酶促反应时间) 取
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出, 每管立即分别加入1m L12m ol 氢氧化钠溶液和2mlDNS 显色液, 摇匀后在对照管中再加入1m L 酶液。将3支试管放入沸水浴中,5min 后立即取出, 流水冷却, 用蒸馏水定容至20m L 后, 用分光光度计以空白值为参比测定OD 值, 以两样瓶管平均值代入下式求出酶活力。
酶活力计算:从标准曲线中查出葡萄糖μm ol 数酶活力(u Πg ) =葡萄糖量/(5×E w )
5为保温时间(酶与底物作用时间,min ) E w 为1m L 酶液中含有的酶量(g )
u 为在特定条件下, 每min 催化纤维素水解生
从图1曲线可知, 该棕红色的氨基化合物在600～470nm 间都有较大的光吸收值, 其最大吸收峰在480nm 处, 文献中采用540nm 和520nm 波长与最大吸收峰偏离较大, 相对灵敏度就较低, 而如果直接于480nm 处测定OD 值, 其数值波动较大, 容易造成不
同时间、不同实验室和不同仪器间重复性差的结果, 而且DNS 显色液本身在480nm 处也有较大吸收值, 对OD 值测定存在干扰作用。选取490nm 作为测定波长是比较合适的, 这样既可避免显色液本身的背景干扰, 提高灵敏度, 又可达到较高重复性的目的。212 酶促反应最适pH
μ成1m ol 葡萄糖的酶量
在考察每一种测定条件对测定结果的影响时,
需要固定其他条件按上述条件进行实验。在上述方法条件基础上, 、反应时间、pH 个主要因素。2 结果与讨论
211 还原糖与DNS 反应产物的最大吸收波长
DNS 测定的是酶对C MC 的糖化力, 其水解产物
酶对环境的酸碱度比较敏感, 其催化活性直接
受溶液pH 值的影响, 只有在适宜的pH 值范围内测定出酶活大小才能真正反映出酶活的高低, 故酶活的测定中pH 。在纤维素大多在410～515之, 有的6, 有的为pH415, 有的为pH414。利用河南省生物工程中心提供的木霉纤维素酶样品, 测定其酶活性与pH 值之间的关系, 结果如图2所示。该酶样品催化底物的最适pH 值416。考虑到生产上应用的多数纤维素酶的pH 在410～510之间, 且多在415～417左右。为统一和便于相互比较, 对于最适pH 值在410～515之间的酶样品, 建议采用pH416测定酶活。而对于最适pH 值不在此范围的酶样品, 如碱性纤维素酶可在其最适pH 值条件下测定。
如纤维二糖, 葡萄糖是还原糖, 能将3,5—二硝基水杨酸还原为棕红色的氨基化合物, 在一定浓度范围内, 还原糖的量与该物质溶液颜色的深浅成一定比例, 可用分光光度计进行测定。用DNS 法测定还原糖方法中所采用的波长有540nm ,520nm ,490nm 等。波长不同则OD 值不同, 据此计算出的酶活力也差别较大。这是不同产品或不同数据之间无法相互比较的原因之一。为此, 在找到对最适酶促反应条件之前, 应先确定还原糖测定所用的最佳波长范围。对DNS 与还原糖反应产物的光吸收特性进行了分析, 其460～620nm 光吸收曲线如图1所示
。
图2 纤维素酶活大小与pH 值关系曲线
213 酶促反应最适温度
图1 DNS 与还原糖反应产物的光吸收曲线
温度对酶促反应速度影响很大。在低温时酶促
反应进行缓慢, 而温度过高会使酶蛋白变性失活使酶的浓度大为降低, 同时酶的最适反应温度不是一
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个不变的常数。例如酶作用时间愈长最适温度愈
低, 反之作用时间愈短则最适温度愈高。用DNS 法测纤维素酶活时, 发现不同的厂家和单位所采用的酶促反应温度差别很大。例如:有的采用50℃, 文献[1]和文献[7]采用40℃, 还有的采用45℃等。不同酶促反应温度所测定的酶活差异甚大, 又是导致不同数据之间相互比较和交流很困难的另一重要原因。纤维素酶活随温度变化情况如图3:
图4 还原糖生成量和纤维素酶活力与酶促反应时间曲线
图4结果表明, 酶促反应1min 后, 酶作用底物产生的还原糖量随时间延长呈直线上升,5min 后还,10min 后, 曲线呈水平, , 在30%, 到10min 时相对酶
图3 纤维素酶活与反应温度曲线
活下降了50%, 此后相对酶活无大变化。由此可
见, 在1～5min 内, 还原糖量变化曲线呈直线上升趋势, 其斜率可以代表酶促反应的初速度, 同时在5min 时, 相对酶活为70%, 所以酶促反应时间5min 比较适宜, 这样既缩短了测定时间, 又便于饲料行业等生产中进行快速测定。
总之, 通过对上述条件的分析, 在用DNS 法测定纤维素酶活力时, 我们认为在50℃,pH416条件下, 酶促反应时间5min ,DNS 显色5min , 于490nm 处测OD 值比较适宜。同时不同测定者由于测定条件的不统一其酶活单位定义也各异, 例如有的定义
μμm ol 、1mm ol 或1g 葡萄糖的酶量为1个1min 水解1
酶活单位, 也有的定义为1h 水解生成1mg 、1mm ol 葡萄糖的酶量为1个酶活单位。为了便于比较, 建议在采用统一的测定方法的基础上,C MC 糖化力酶活
μ单位采用国际单位, 即1min 水解生成1m ol 葡萄糖
的酶量为1个活力单位。
参考文献
1 刘亚力, 陈宏, 朱元招1饲料研究,1998, (2) :17—192 中山大学生物系生化微生物教研室1生化技术导论1人
从图3中可知, 在36～58℃之间相对酶活随着
温度升高而升高, 当温度在58～62℃之间时, 相对酶活性没有明显变化, 曲线近似呈水平状态, 在40℃、45℃、50℃条件下, 其相对酶活分别为56%、70%、80%, 而当温度大于58℃以上时相对酶活不再升高。其原因可能是温度偏高造成部分酶失活。考虑到大多数情况下纤维素酶作用底物的最适温度在45～65℃之间, 所以我们认为用DNS 法测定纤维素酶活时, 酶促反应温度以50℃为宜, 能更真实地反映酶活性高低。214 酶促反应时间
在一定条件下, 酶与底物作用时间与酶促反应速度关系非常密切。测定酶活力的一个重要原则就是测定其初速度, 但初速度的测定非常不容易掌握。有时在一瞬间酶与底物的结合达到饱和, 即达到最大反应速度。同时, 当酶解产物达到一定浓度会对酶产生反馈抑制作用, 故时间过长反而不能真正代表酶的活力。目前, 在用DNS 法测定纤维素酶活的方法中酶与底物作用时间多采用30min 、15min 或10min , 也有用5min 的。时间过长或过短都不能准确反映样品的酶活力大小。在其他条件不变时, 酶活力大小与酶促反应时间的关系如图4所示
。
民教育出版社,1979…3 朱俭, 等1生物化学实验1上海科学技术出版社,19814 北京大学生物系生化教研室编1生物化学实验指导1人民教育出版社,19805 张树政, 等1酶制剂工业1科学出版社,1984
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