活化血小板检测方法
活化血小板检测方法
1． 临床意义
心肌梗塞、脑血管血栓形成、深静脉血栓形成、脑栓塞和肺栓塞等血栓性疾病在中国有很高的发病率，也是致死的重要原因。血小板活化是血栓形成的重要环节，检测血小板的活化状态可辅助诊断和监控血栓性疾病，对判断血栓前状态意义也非常重大。
2． 检测原理
静止状态的血小板内分布着多种颗粒，如a颗粒、溶酶体颗粒等。这些颗粒表面存在着一些特定蛋白，如a颗粒表面有CD62p抗原，溶酶体颗粒表面有CD63抗原。血小板活化时，由于颗粒膜蛋白与血小板膜蛋白相互融合，使颗粒膜蛋白翻转到血小板膜表面。因此，可通过检测这些颗粒膜蛋白来判断血小板的活化状态。
3. 采血
EDTA抗凝采血，取后段血。因前段血中可能有组织液存在，造成人为血小板活化。
4. 试剂选择
FITC标记的CD42b抗体
PE标记的CD62p或CD63抗体
在血小板膜表面稳定表达的抗原有CD41/CD61(GPIIb/IIIa)和CD42a, CD42b等，这些抗原均可作为血小板的标志。但因中国存在着一部分血小板无力症患者，其血小板表面缺乏CD41/CD61(GPIIb/IIIa)。因此，一般使用CD42b来鉴别血小板。
因一般情况下，CD62p和CD63的表达率均较低，需用PE等荧光较强的荧光素标记检测。
5. 染色
a. 全血法：
1) 取试管A(阴性对照)和试管B(测定管)，均加入5ml 抗凝全血和200ml PBS
2) A管中加入适量的CD42b-FITC和阴性对照抗体(对应于CD62-PE或CD63-PE)
B管中加入适量的CD42b-FITC和CD62-PE或CD63-PE抗体
3) 室温，避光孵育25分钟
4) 加2 ml PBS，上机检测
血小板在体外随着时间的延长会自发活化，所以由采血到检测一般要在3小时内完成。
b. 固定法：
1) 抗凝全血 800rpm 离心10分钟，取上清液即PRP(富血小板血浆)
2) 以等体积1-2%的多聚甲醛固定 10分钟
3) PBS洗涤1次，用PBS调节细胞浓度为 1×107个/ml左右
4) 分别在试管A(阴性对照)和试管B(测定管)进入100ml血小板悬液
5) A管中加入适量的CD42b-FITC和阴性对照抗体(对应于CD62-PE或CD63-PE)
B管中加入适量的CD42b-FITC和CD62-PE或CD63-PE抗体
6) 其余步骤同全血法
固定法可避免血小板在体外因时间或操作造成的人为活化，固定后的血小板可在5天内检测。
而固定法的步骤较为繁琐，耗费时间，且在制备PRP时需离心，容易带来人为活化。所以很多实验室还是倾向于全血法。但是如果采血后不能立即检测(3小时内)，则需用固定法。
6. 分析
1) 用CD42b表达量和侧向散射光设门来选定血小板
选定血小板过去常用的方法是FS(C)/SS(C)设门，根据细胞的大小与颗粒度来确定血小板。然而血小板的大小不一，有些血小板较大，容易与红细胞相混淆，尤其当活化时，血小板与白细胞发生粘附，在FS(C)/SS(C)图上进入白细胞群，使得一部分血小板丢失，因此应用该法对血小板进行选定不够准确。
目前公认的方法是用血小板特异性标志来选定血小板，因无论血小板大小，无论其是否活化，均稳定表达CD41/CD61(GPIIb/IIIa)和CD42a等，因此可以非常精确地区分血小板。
2) 做阴性对照管，调节阳性区的假阳性率为1-2%
3) 做测试管，得出CD62p的表达率，及血小板活化的百分率