Agilent液相色谱柱与应用简单介绍
Agilent 液相色谱柱与应用简单介绍
Bruce Lee
1. 概述
Agilent 生产液相色谱柱以及气相色谱柱,其液相色谱柱家族涵盖正相色谱柱,凝胶色谱柱,反相色谱柱以及手性分析色谱柱(ultron )。反相色谱柱家族填料基质主要以Zorbax Sil以及Zorbax Rx-Sil为主,分离分析范围涵盖小分子至生物大分子聚合物。其中Zorbax 家族色谱柱主要包括Zorbax Eclipse XDB系列,Zorbax Eclipse Plus系列,Zorbax 80Å Stable Bond系列,Zorbax 80Å Extend-C18,Zorbax Bonus RP,Zorbax Poroshell系列,Zorbax Polaris系列,Zorbax Pursuit系列。
Zorbax 色谱柱的填料基质硅胶采用自家生产的B 型高纯度硅胶,其生产方式采用典型的堆砌珠法(聚合诱导胶体聚集法)。通过在硅溶胶分散体系中的聚合反应,将纳米级硅溶胶包结成有机-无机复合微球,烧结除去有机物后得到全多孔硅胶微球(如下图1所示)。
Fig. 1 堆砌珠法全多孔硅胶微球生产工艺
据Agilent 公开资料显示,其生产的全多孔硅胶微球中Na, Al, Fe等金属杂质的总量<100 ppm ,使得该硅胶在低pH 下的稳定性相比酸性A 型硅胶的稳定性得到显著的改善。 其推荐的方法开发流程如下图2所示。
Fig. 2 pH从低到高方法开发指南
2.1.Zorbax Eclipse XDB色谱柱
该系列色谱柱包括C18,C8,Phenyl ,CN 等四种,其色谱柱的典型物化特性列于下表1。
Tab. 1 Zorbax Eclipse XDB色谱柱典型物化特性
Zorbax Eclipse XDB色谱柱粒径均为80 Å,比表面积均为180 m2/g,最高允许操作温度均为60℃,均采用三甲基硅氧烷二封端,烷烃侧链均为甲基(空间位阻效应较低),表面载碳量与烷烃链碳数呈正比例变化(区别与Waters BEH XBridge色谱柱),除XDB-CN 柱pH 范围为2-8之外,其余三种均为2-9。从其表面载碳量看,对于样品的负载量,XDB-C18柱最大,而XDB-CN 柱则最小。
该系列色谱柱烷烃链与硅胶基质的键合方式如下图3所示,其工艺无法从公开资料获得。
Fig. 3 XDB系列色谱柱烷烃链与硅胶基质的键合方式
从其键合方式可以看到,该系列色谱柱的硅胶表面的裸露硅羟基的封端方式为三甲基硅氧烷,此外与烷烃键合的Si 的两个侧链为甲基,其空间位阻效应比较小,二次封端基本可以将大部分硅胶表面裸露硅羟基封端。
此外,该系列色谱柱采用单键合方式(区别于三键键合方式),使得有限的硅胶表面可以键合相对更多的烷基链(但低于Waters C18,C8,Phenyl 色谱柱);另一方面,单键键合方式对于低pH 条件的稳定性也要比三键键合方式要差。三甲基硅氧烷封端方式,长期于低pH 条件下应用,封端Si-O 键可能会发生水解,导致被分离分析物(特别是碱性化合物)的色谱峰拖尾。XDB-C18色谱柱稳定性如下图4所示(引自Agilent )。
Fig. 4 XDB-C18色谱柱稳定性(pH=3, 60℃)
该图中Competitive C数据,个人觉得不具有可参比性,原因不多说。从其数据来看,结合其填料特性,封端方式以及烷烃链键合方式,该系列色谱柱如需长期应用与酸性流动相体系下,其pH 最好控制在3-7为宜(pH >7,硅胶内部聚合发生断裂的可能与速率加快);而温度建议不超过40℃。
该系列的四种色谱柱,XDB-Phenyl 以及XDB-CN (可应用正相模式)两种色谱柱可能会提供与XDB-C18以及XDB-C8不同的选择性(下图5),而这种选择性与“Agilent 本身”无关,取决于苯基以及氰基与C8,C18的不同。而对于Agilent 所声称的“超密度键合”,则需要有区别地,有对比地看待;而对其“宽pH 范围(pH 2-9)内提供良好的峰形”(下图6),除对色谱柱进行选择之外,亦需要对流动相给予关注。
Fig. 5a Zorbax Eclipse XDB色谱柱的选择性
Fig. 5b Zorbax Eclipse XDB色谱柱的选择性
Fig. 6 拖尾因子比较
3. Zorbax Eclipse Plus色谱柱
该系列色谱柱包括Zorbax Eclipse Plus-C18,Zorbax Eclipse Plus-C8,Zorbax Eclipse
Plus-Phenyl 三种色谱柱。该系列色谱柱与Zorbax Eclipse XDB色谱柱一样,均采用“超密度键合”以及二封端技术,区别在于使用增强的高性能硅胶、新的封端试剂以及为高性能硅胶而优化的独特键合工艺。具体物化参数如下表2所示,分离分析范围覆盖碱性,酸性以及中性化合物。
Tab. 2 Zorbax Eclipse Plus色谱柱物化参数
从上表中数据与XDB 系列相比,Plus-C18以及C8具有更大的粒径,相对减少的比表面积以及减少的载碳量。从公开资料中暂未找到“增强的高性能硅胶、新的封端试剂”的相关介绍,有可能是金属离子含量更低的硅胶(<<100 ppm)以及空间位阻更大的封端试剂。 在中性流动相条件下,与其他厂家色谱柱对弱碱/酸性化合物的分离效果比较,如下图7。
Fig. 7 Plus-C18
与其他厂家色谱柱对弱碱/酸性化合物的分离效果比较
4. Zorbax 80Å Stable Bond色谱柱
Zorbax 80Å Stable Bond系列色谱柱包括SB-C18,SB-C8,SB-C3,SB-CN ,SB-Phenyl ,SB-Aq 六种色谱柱。该系列色谱柱与XDB 以及Plus 色谱柱的区别在于低pH 以及高温条件下的稳定性。该系列色谱柱均采用单键键合,不封端的方式,其物化参数如下表3所示。
Tab. 3 Zorbax 80Å Stable Bond色谱柱物化参数
如上表所示,温度可达80-90℃,pH 可低至1。该系列色谱柱较适合使用在低pH 环境下,对于温度的稳定性最好;若需使用中等pH 范围(6-8),其温度最好不要超过40℃,使用磷酸氢铵意外的缓冲盐溶液,可增强色谱柱的寿命。化学键合方式如下图8所示。
Fig. 8 Zorbax 80Å Stable Bond色谱柱化学键合方式
其中SB-C18R 基为二异丁基,其余如SB-C8等的R 基为异丙基,两种基团均具有较大的空间位阻,避免硅胶基质在低pH 条件下被水解破坏,造成塌陷。
SB-C18色谱柱在低pH 和高温条件下的稳定性如下图9所示。
Fig. 9 Stable Bond SB-C18在低pH 和高温条件下显示出极佳的稳定性
此外SB-Aq 色谱柱兼容100%水相,而不会出现“孔内去湿”现象。
5. Zorbax Bonus RP色谱柱
Bonus-RP 色谱柱,特点在与长烷基链中嵌入的极性酰胺基团(与其他厂家RP 柱类似)。减少了碱性化合物和硅胶基质之间的相互作用,改善碱性化合物的峰形。三封端进一步改善了峰形,并延长了色谱柱寿命。
此外,二异丙基侧链(图10)提供的空间位阻防止封端酸性水解,延长了在低pH 条件下的寿命。
Fig. 10 Bonus RP色谱柱二异丙基侧链
Bonus RP色谱柱的键合方式为单键键合(图11),Bonus-RP 色谱柱提供了不同于C18 和C8烷基键合固定相的选择性。
Fig. 11 Bonus RP色谱柱键合方式
其物化参数如下表
4所示
Tab. 4 Zorbax Bonus RP色谱柱物化参数
Bonus RP色谱柱如其他RP 色谱柱一样,完全兼容100%水相。
5.Zorbax Extend-C18色谱柱Zorbax Extend-C18色谱柱采用双配位C18-C18单键键合技术(图
12),提高色谱柱在高pH 条件下的稳定性,C18-C18键合方式也使得载碳量得到提升(表
5)。
Fig. 11 Bonus RP色谱柱键合方式
Tab. 5 Zorbax Extend-C18色谱柱物化参数
该色谱柱可通过将pH 调整至分析物的pKa 以上2个单位,使得碱性分析物呈电中性,与烷基链通过疏水相互作用而得到良好的峰形。
To be continued。。。
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