s维持胚胎干细胞自我更新分子机制的研究进展

2004; 31(11) 　　　　　　　生物化学与生物物理进展　　Prog. Biochem.

Biophys. ・965・

维持胚胎干细胞自我更新

分子机制的研究进展3

姜祖韵1) 　袁毅君1,2) 　明镇寰1) 　张　铭1) 33

(1) 浙江大学生命科学学院, 杭州310012;

2)

天水师范学院生命科学与化学学院, 天水741000)

摘要　胚胎干细胞通过特殊内源性分子的表达, 以及微环境中多种细胞因子和胞外基质的刺激, 构成信号网络, β共同调控自我更新. 近年来, 通过对Oct3/4、Nanog 等胚胎干细胞特殊分子标记, 以及L IF 2STA T3, Wnt 22连环素, BMP 2Id 等信号通路的研究, 探讨了胚胎干细胞自我更新信号网络的分子机制. 维持自我更新的关键在于胚胎干细胞生长微环境中的各种细胞因子和胞外基质的含量, 以及细胞内源性特异分子表达量之间的平衡. 关键词　胚胎干细胞, 自我更新, 信号网络, 分子机制学科分类号　Q813, R394

　　胚胎干细胞(embryonic stem cell , ESC ) 是一类具有自我更新能力的多潜能性细胞, 在体外特定培养条件下, 能维持不分化状态, 并具有增殖能力. 从囊胚期的内细胞团(ICM ) 和早期胚胎的原始生殖细胞(P GCs ) , 命名为ES 和EG. 个小鼠胚) . 年, Thomson 等[1](HES ) 系. 研

细胞中都有表达. 如果没有外源性白血病抑制因子(L IF ) 存在, 缺失Oct3/4ESC 会分化成滋], , , 而ESC 的分化[5]. 推测可能控制ESC 自我更新和分化两条途径:

究揭示L IF 能够维持M ES 的自我更新, 但不能维持HES 的自我更新, 由此发现维持ESC 自我更新的是一个复杂体系. ESC 自身表达一些特异的分子, 并且受到一系列可溶性细胞因子和不溶性胞外基质的共同刺激, 引起多个转录因子通过不同的信号通路, 构成复杂的信号网络系统, 在基因水平共同调节ESC , 最终决定其自我更新或者分化. 本文就ESC 自我更新的最新研究进展进行综述, 旨在初步探明ESC 自我更新信号网络的分子机制.

一条通路是Oct3/4阻止ESC 向滋养层方向分化; 另一条是Oct3/4会引起ESC 向内胚层分化. 112　同源蛋白转录因子N anog

同源蛋白转录因子Nanog 是最近在小鼠和人的ESC 中发现的一类新的特异性分子标记[6,7]. 其同源域在不同品系小鼠中有94%相同, 在不同人种中有87%相同. Nanog 的cDNA 由2184个核苷酸组成, 包含一个开放阅读框, 编码305个氨基酸. 其3′端有一个由1077个碱基组成的非翻译区域, 包含一个B2重复元件. B2在胚胎细胞中高水平表达, 调节Nanog 的表达.

Nanog 在维持干细胞和小鼠囊胚外胚层的多潜能性中是必需的, 在ICM 、ES 和EG 中都有表达. 缺失Nanog 基因引起ESC 向体壁和内脏方向的内胚层分化. Nanog 抑制分化的一个机制可能是抑制了一些促分化基因如gata 4和gata 6的转录. 因为在ES 细胞中强制性表达gata 4和gata 6会使其向内胚层分化[8], 在gata 6过量表达的细胞和Nanog

　3浙江省重大项目(J [1**********]116) , 湖州中心医院合作项目

(H[1**********]536) .

1　胚胎干细胞特殊分子标记(ESC 2specif ic markers)

　　ESC 表达一些特殊的分子标志, 如细胞内转录因子Oct3/4、Rex 21和U TF 21等, 碱性磷酸酶(AP ) 、阶段特异性胚胎抗原(SSEA 21、SSEA 23、SSEA 24) 、转录调控抗原(TRA 21260、TRA 21281) 、同源蛋白转录因子(Nanog ) 等. 在启动分化过程中, 这些分子的表达量都有明显的下调[2, 3]. 111　Oct3/4在ESC 中维持自我更新和促进分化

　33通讯联系人.

　Tel :[1**********]23, E 2mail :zhangming-ls @zju. edu. cn 　收稿日期:2004205218, 接受日期:2004208231

的双重作用

Oct3/4由Pou 5f 1基因编码, 在所有的ESC

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)

缺失的细胞中, 其他标志基因的表达模式基本一样. gata 6是gata 4的上游基因, gata 6直接影响gata 4. gata 6增强子区域中包含一个Nanog 的DNA 识别序列, 表明Nanog 可能直接调控gata 6. 另外, Nanog 的共有序列在Rex 21的增强区域中发现, 显示Nanog 也可能通过调节一些ESC 特异性基因维持其多潜能性.

自我更新[11,12]. Wnt 蛋白的受体Frizzled 5、下游目标调控因子FRA T2和细胞周期蛋白D1在M ESC 中大量表达, 没有发现其他的相关配体表达, 说明这条途径不是细胞自分泌途径[2]. 在不添加L IF 时, 利用一种新的来源于软体动物海螺体的GSK 23特异性抑制剂62溴靛红23′2肟(62bromoindirubin 23′2oxime , B IO ) , 能维持ESC 的自我更新. 撤去B IO 后, ESC 恢复分化能力[12]. 这进一步说明了Wnt 信号通路在维持ESC 自我更新中的重要作用. 饲养层中分泌能维持HES 自我更新的物质是否和Wnt 信号蛋白相关呢? 213　BMP 信号通路

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein ,

β家族的细胞因子, 在未分化BMP ) 是属于TGF 2

的ESC 中发现有大量的G DF 23/BMP 2R1A 信号富集[2]. 无血清的培养条件下, L IF 不能维持M ES

, , 这表明血清中L 的不分化状态. BMP4和L IF 却能

β家族的另外两种细. TGF 2

胞因子G DF6和M IS 也有这种作用. 在BMP4和

G DF6表达的ESC 细胞中, 下游信号蛋白Smad1发生快速磷酸化作用, 最终激活Id (inhibitor of differentiation ) 基因, 产生负调节因子, 调节ESC. 在血清存在条件下, Id 基因的表达增加. 在外源性持续表达Id 基因的ES 细胞中, 只添加L IF , 也能维持ESC 自我更新. 如果没有L IF , 那么ESC 向神经细胞分化. 在ESC 细胞中, 有神经元基因Mash 21表达, 从而推测Id 基因阻碍Mash 21的表达. 这说明血清中存在BMP , 是另外一条维持ESC 自我更新的平行通路[13].

2　胚胎干细胞自我更新的信号通路

信号传导途径在ESC 的自我更新中有很重要的作用, L IF -STA T3在M ESC 中维持自我更新[9]. Sato 等[2]研究表明, 在HES 的918个丰富表达的基因中, 有17%与信号通路相关, 包括F GF 、BMP 和Wnt 途径等. 211　L IF -STAT 信号通路

白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor , L IF ) 是一种多功能糖蛋白, 有分泌型和基质型两种. 在M ESC 体外培养过程中, 单独利用小鼠成纤维饲养层或者L IF 可以维持自我更新. L IF 两条途径作用于M ESC , , 增殖. L IF L 聚体, JA (Janus tyrosin kinase ) , STA T3(signal transducers and activators of transcription ) ; L IF 也可通过MAP K /ER K (mitogen 2activated protein kinase/extracellular 2regulated kinase ) 途径调节M ESC [9].

但L IF 对HESC 无明显作用[1], HESC 需要饲养层或者饲养层的条件培养液和胞外基质Matrigel 共同维持自我更新[10]. 212　Wnt 信号通路

Wnt (wingless int ) 信号通路参与多种细胞的

β基因表达、增殖、分化和凋亡途径, 其中Wnt 22连环素通路已经研究得比较清楚, Wnt 信号蛋白

结合细胞表面受体蛋白Frizzled , 受体下游信号导致糖原合成酶激酶23(glycogen synthase kinase 23, GSK 23) 失活, 造成APC 蛋白(adenomatous polyposis coli protein ) 和GSK 23形成不稳定的蛋白

β2连环素(2catenin ) 积复合物, 最终导致核内的β

累, 引起一系列Wnt 目标信号, 如细胞周期蛋白

D1、c 2myc 、Axin 2和BMP 等, 调节细胞增殖、分化和凋亡等功能.

β最近, 发现Wnt 22连环素通路能维持ESC 的

3　胚胎干细胞各条信号通路之间的网络模式

多个因素构成一个庞大的维持ESC 自我更新

能力的网络, 其中特异分子和各种转录因子的最终表达量是决定ESC 是否分化的关键. 当各种因子分泌量达到相互平衡的状态时, ESC 维持自我更新, 但是如果其中一个或几个因子的表达量改变时, 就会促使ESC 向某个方向分化. 从现有的研究来看, 主要有Oct3/4、Nanog 、L IF 、Wnt 和BMP 等几条既平行又相互交错的通路在决定ESC 的自我更新(图1) .

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Fig 11　The regulation 图1　[5～7,12,13]

)

　　, 单独或综合添加层粘连蛋白、纤粘连蛋白、L IF 和F GF 24四种成分, 结果发现任何单独的成分对维持M ESC 自我更新的能力很小, 如果联合添加L IF 、F GF 24和层粘连蛋白则会引起M ESC 的分化. 这说明ESC 的自我更新是多个因素的综合, 并非单独作用, 并且表达量的多少也直接影响自我更新[2].

缺失Oct3/4基因, 导致ESC 分化, 但是Nanog 仍能表达. 在Nanog 过量表达的ESC 细胞

直接调节STA T3, 而无需通过L IF 2STA T 途径, 或者通过另外一条完全和L IF 平行的途径而实现自我更新.

在Nanog 过量表达的ESC 细胞中, 不需要添加BMP 也能维持ESC 的自我更新, 并且Nanog 维持Id

基因的表达[13], 显示BMP 信号和Nanog 之间有着密切的关系. BMP 和L IF 信号途径共同作用维持M ESC 的自我更新. 过量表达Smad1或者持续激活BMP 受体, 即便在L IF 存在的条件下, 也导致其向非神经元方向分化[13]. 表明STA T3和Smad1相对平衡的表达量决定M ESC 的自我更新.

中, 不能逆转由于缺失Oct3/4基因而引起的ESC 分化, 也没有Oct3/4表达量增加的现象, 说明Nanog 不直接作用Oct3/4的表达[6]. Nanog 可能

在Wnt 信号通路中, 如果APC 突变或者β2连环素持续表达, BMP 水平上调, 抑制ESC 向神经细胞分化, 但是促进其向外胚层和中胚层分化. 这说明Wnt 途径直接调控BMP , 阻止ESC 向神经细胞分

阻碍Oct3/4向内胚层分化之间的信号通路, 从而保持ESC 的不分化状态. 由此看来, Oct3/4和Nanog 在ESC 的自我更新中控制两条途径, 但是Nanog 可能控制Oct3/4在ESC 分化作用途径中的

化[11].

目前的研究结果还不能确切知道细胞内部如何维持ESC 自我更新的精确途径. M ESC 和HESC 的分子机制并不完全相同, 这种差异的本质是通过哪些信号途径来实现, 如L IF 途径和Wnt 途径之间共同作用的位点分子是什么? 在HESC 中, 需要

碱性成纤维生长因子(bF GF ) 来维持其自我更新,

一些位点.

在L IF 的存在下, 缺失Nanog 基因仍能保持ESC 的自我更新能力. 用L IF 受体缺失的ESC 细

胞的实验结果显示了Nanog 不受L IF 2R 2G p130信号途径的调控. Nanog 能在JA K 阻断的前提下, 保持ESC 自我更新的能力[6]. Nanog 可能本身就

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)

7　Mitsui K , Tokuzawa Y , Itoh H , et al . The homeoprotein Nanog

is required for maintenance of pluripotency in mouse epiblast and ES cells. Cell , 2003, 113(5) :631～642

8　Fujikura J , Yamato E , Y onemura S , et al . Differentiation of

embryonic stem cells is induced by GATA factors. G enes Dev , 2002, 16(7) :784～789

9　Prudhomme W , Daley G Q , Zandstra P , et al . Multivariate

proteomic analysis of murine embryonic stem cell self 2renewal versus differentiation signaling. Proc Natl Acad Sci USA , 2004, 101(9) :2900～2905

10Xu C H , Inokuma M S , Denham J , et al . Feeder 2free growth of

undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol , 2001, 19(10) :971～974

11Haegele L , Ingold B , Naumann H , et al . Wnt signaling inhibits

neural differentiation of embryonic stem cells by controlling bone morphogenetic protein expression. Mol Cell Neurosci , 2003, 24(3) :696～708

12Sato N , Meijer L , Skaltsounits L , et al . Maintenance of

pluripotency in human and mouse embryonic stem cells through activation of Wnt signaling by a pharmacological GSK 232specific inhibitor. Nat Med , 2004, 10(1) :55～63

13Y ing Q L , Nichols J , Chambers I , et al . BMP induction of Id

proteins suppresses differentiation and embryonic stem cell self 2in collaboration Cell , 2003, 115(3) :～292

bF GF 又通过哪条信号通路? 随着ESC 分子机制的

进一步研究, 相信网络信号的调控机制将真正揭开ESC 自我更新的面纱.

参　考　文　献

1　Thomson J , Itskovitz J , Shapiro S S , et al . Embryonic stem cell

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human embryonic stem cell lines maintained in a feeder 2free culture system. Dev Dyn , 2004, 229(2) :243～2584　Nichols J , Zevnik B , Anastassiadis K , et al . Formation of

pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct 24. Cell , 1998, 95(3) :379～3915　Niwa H , Miyazaki J , Smith A G. Quantitative expression of Oct3/

4defines differentiation , dedifferentiation or self 2renewal of ES cells. Nat genet , 2000, 24(4) :372～3766　Chambers I , Colby D , Robertson M , et al . Functional expression

cloning of nanog , a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cell. Cell , 2003, 113(5) :643～655

Mechanism Embryonic Stem Cells Self 2rene w al 3

J IAN G Zu 2Yun 1, YUAN Y i 2J un 1,2, M IN G Zhen 2Huan 1, ZHAN G Ming 1

(1) College of L if e Science , Zhejiang U niversity , Hangz hou 310012, China ;

2)

) ) ) ) 33

College of Life Science and Chemistry , Tianshui normal University , Tianshui 741000, China )

Abstract 　Some intrinsic ESC 2specific markers , cytokines and extracelluar matrix in the microenvironment compose of a complex network to co 2regulate ESC self 2renewal. The molecular mechanism of signal network maintaining ESC self 2renewal was investigated by studying the ESC 2specific markers , such as Oct 24and Nonog

βrecently. Moreover , ESC signal pathways , just like L IF 2STA T3, Wnt 22catenin and BMP 2Id , were further deeply studied. In conclusion , the most important key to maintain ESC self 2renewal is the balance among the content of various cytokines , extracelluar matrix , and expressing quantity of intrinsic ESC 2specific markers by different signal stimulators.

K ey w ords 　embryonic stem cell , self 2renewal , signal network , molecular mechanism

　3This work was supported by grants from The Major Research Program of Zhejiang Province from The Science and Technique Department of

Zhejiang Province (J [1**********]116) and The Central Hos pital of Huzhou City (H[1**********]536) .

　33Corresponding author. Tel :[**************], E 2mail :zhangming-ls @zju. edu. cn 　Received :May 18, 2004　　Accepted :August 31, 2004