超薄切片制作业
人前列腺PC-3培养细胞透射电镜超薄切片制备
一、细胞的制备
将PC-3 细胞培养于RPMI-1640培养液中( 其中添加10%胎牛血清，100ug/mL青霉素和100ug/mL链霉素) ，细胞传代使用0.25%胰蛋白酶消化，每 2d 换1次培养液。当细胞培养至对数生长期时，用胰蛋白酶消化获得细胞，用PBS 多次洗涤，分别以每孔1×104个将细胞接种到96孔板中，细胞接种后继续培养24h ，然后用于细胞实验[1]。
二、细胞的固定
将培养的悬浮细胞倒入尖底离心管, 然后将细胞连带培养液在1000-1500rpm 下离心10min 左右。离心完毕到出培养液，管底的细胞团不要打散，沿管壁缓慢导入材料体积5-10倍的3%戊二醛固定液，固定约1h ，也可在4℃冰箱固定过夜[2]。 也可以采取加入熔化的琼脂(琼脂的温度约30℃, 温度过高会使细胞变形) 与样品混合均匀, 冷却后凝成胨, 再用戊二醛固定。细胞数量极少时, 可用Effendorf 管离心、去上清液, 加入熔化的琼脂, 冷却凝胨后, 再用刀片切开塑料管, 取出样品, 用戊二醛固定[3]。后固定：1%锇酸固定1 h, 0. 1mol/L磷酸缓冲液清洗2次, 10 min /次。
三、脱水浸透
系列酒精脱水, 按递增浓度进行，从30%、50%、70%、90%、100%。由于乙醇和环氧树脂互溶性差，然后再用丙酮按照同样的方法脱水。向培养皿中加入薄薄一层Epon812混合包埋液浸透30 min。
四、样品的包埋
原位包埋法：（1）细胞长在载玻片上:将细胞连同载玻片一起固定、脱水和浸透。细胞面朝上与液体直接接触。在光镜下先选好被观察的细胞区域然后再包埋。（2）细胞养在可拆卸的96孔板内:样品制备在板内进行, 固定、脱水、浸透和包埋均按上述方法操作, 聚合后用锤子砸碎塑料外壳, 取出样品块, 修块后可直接切片。（3）细胞长在滤膜或胶原上:将滤膜或胶原视为一个组织块, 按上述制备方法进行固定、脱水和浸透, 最后用定向平板包埋板包埋。由于样品很薄, 块面修成0.1mm ×0.2 mm长方形。切片前应尽量修去多余的树脂, 以便切片和观察。（4）原位特定细胞培养在35mm 塑料培养皿或6孔板中:按上述制备方法在培养皿内进行固定、脱水、浸透、包埋和聚合。聚合后的样品块必须先定位再修块。
用单面刀片和手术剪刀将培养皿从中间剖开, 将事先灌好包埋液的胶囊倒扣在其中一半培养皿上; 另一半培养皿剪切成0. 5 cm ×1. 0cm, 竖直放入胶囊中包埋，70℃聚合12 h[4]。
五、超薄切片、染色及电镜观察
包埋的细胞按实体组织进行常规超薄切片。醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色10min, 收集铜网上置于电镜下观察。
参考文献
[1]朱清毅, 胡 瑞, 刘 丽, 等. 槲皮素对前列腺癌PC-3细胞凋亡作用的研究[J].中华男科学杂志. 2011,17(9):790-793.
[2]吴岩. 电镜技术与实验指南[M].内蒙古：内蒙古人民出版社，2013.46-47.
[3]杨怡, 张德添, 张飒, 等. 培养细胞透射电镜超薄切片制备方法[J].电子显微学报.2004,23(4):506-506.
[4]吕广艳，曲淑贤，高船舟，等. 培养平滑肌细胞原位包埋超薄切片的制备[J].大连医科大学学报.2010,32(2):227-228.