银纳米粒子的影响在老鼠胚胎干细胞自我更新和增殖
纳米银对老鼠胚胎干细胞自我更新和增殖的影响
关键词:
银纳米颗粒(AgNPs)鼠标胚胎干细胞(制) 自我更新和扩散Nanotoxi
由于独特的抗菌性能,纳米银颗粒(AgNPs)在常用的医学和商业产品得到迅速普及。AgNPs 对干细胞自我更新和增殖的影响的分子机制尚不清楚。本工作的目的是把小鼠胚胎干细胞作为细胞模型来鉴定AgNPs 的毒性。胚胎干细胞是一个非常特殊的细胞类型,它具有自我更新和分化能力。这个实验的目的是确定AgNPs 与不同表面化学成分结合对小鼠胚胎干细胞自我更新和细胞周期的影响。AgNPs 两种不同表面化学成分,多糖包被和烃包被用来实验他们对小鼠胚胎干细胞自我更新和增殖的毒性作用。结果表明, 两种多糖包被和烃包被的 AgNPs都能改变小鼠胚胎干细胞的细胞形态。细胞周期分析表示AgNPs 通过抑制的视网膜母细胞瘤(Rb)的蛋白质高度磷酸化使细胞周期阻滞在G1和S 。此外,AgNPs 暴露减少Oct4A 同种型表达,对小鼠胚胎干细胞潜能的多能性负责并诱导几种异构体OCT4B-265,OCT4B-190,OCT4B-164的表达参与干细胞应激反应的表达。此外, AgNPs 与两种不同表面化学成分的产生(ROS)支持我们的假设, AgNPs 毒性暴露是由于改变了基因表达和蛋白质的修改导致ROS 过度的表达。多糖涂层减少活性氧的生产, 从而降低了AgNPs 毒性
介绍
纳米技术是一个在医学和常用的生产产品中快速增加使用的领域 [1 - 3]。在数百种产品纳米材料中AgNPs 是使用最广泛的。AgNPs 因为独特的抗菌性能通常用于医学和商业产品中,在医学伤口敷料、手术器械和医疗口罩都减少微生物种群[4 - 6]。他们也作为过滤剂在加湿器和水净化设备中使用[7]。
由于他们的小体积和高表面积使得AgNPs 具有很高的化学活性, 并产生大量活性氧(ROS)[8]。活性氧和自由基产生会导致氧化应激, 产生炎症,导致蛋白质、DNA 和膜损伤。基于成纤维细胞研究表明AgNPs 可以进入人类纤维肉瘤, 初级神经细胞和皮肤癌细胞,而且诱导活性氧和细胞死亡同时导致氧化应激(9 - 12)和DNA 损害。另一项研究表明, AgNPs 通过上调p53介导的凋亡通路诱导细胞死亡 [13]。AgNPs 增加引起的p53的表达, p53是一个抑癌基因,p21, 病因, 蛋白 ,蛋白质和DNA 损伤修复Rad 51和H2AX(11、14、6、15) 。
这个实验设计的目的是确定的AgNPs 在有和没有涂层时对小鼠胚胎干细胞自我更新和细胞周期的影响。AgNPs 常见是应用多糖包被作为涂层/稳定剂。它已经表明, 涂层将影响颗粒的形状、大小和表面性质从而促成AgNPs 毒性[16]。很多研究显示纳米颗粒进入一些的人类体细胞和非哺乳类细胞比如斑马鱼与毒
一个极好的研究工程纳米颗粒潜在的毒性的细胞模型(19、20) 。我们的长期目标的研究了解AgNPs 对小鼠胚胎干细胞的自我更新和增殖有毒的影响,和发展一个干细胞测试(EST)作为工具根据其毒性的潜力把设计工程纳米颗粒(NPs) 分类。我们假设AgNPs 暴露后生产过剩的活性氧可以诱导氧化应激, 导致改变关键调节基因表达和蛋白质修饰, 从而抑制细胞更新和细胞增殖。进一步的, 适当的AgNPs
预防活性氧的生产从而可以减少毒性。
ESCs 自我更新属性和多潜能特点是由几个的相互作用网络转录因子包括Oct4和Nanog 。Oct4是一种调节因子,只在ES 中能找到。OCT4基因通过可变剪接可以产生至少两种mRNA(OCT4A OCT4B) 由 (21、22) 。OCT4A 是最常见的转录产物, 被翻译成一个完整的OCT4蛋白质定位于细胞核,有被POU dna 结合域隔开的N – C末端结合结构域。该转录物是负责胚胎干细胞全能性的转录因子。相比之下, Oct4B转录物被剪切没有外显子1。因为Oct4B 不能维持胚胎干细胞自我更新,意味着它可能是负责细胞应激。此外,单个OCT4B 转录物可以通过OCT4B mRNA 的内部位点选择翻译至少生成三种蛋白质亚型,OCT4B-265,OCT4B-190和OCT4B-164。通过内部网站翻译的替代办法信使rna[23]。然而,Oct4B 的功能以及它替代翻译的监管机制尚不清楚。我们的研究结果提供了证据支持Oct4B 的功能干细胞应激反应。
细胞周期调节由响应于各种细胞内和细胞外信号的细胞周期控制系统监测。如果细胞是有应激反应, 控制系统将在某一个检验点关闭细胞周期。我们检测了视网膜母细胞瘤(Rb )的表达,是通过一个关键的蛋白质在G 1 / S 时期抑制细胞周期,从而对遗传毒性应激反应起到保护作用。Rb 的高磷酸化使蛋白质失活,E2F 转录因子分离并将促进细胞进入细胞周期的S 期。如果Rb 低磷酸化或不含磷的,它的活性和残余仍然附着在E2F 转录因子上, 导致细胞周期阻滞。研究有关AgNPs 的蛋白质修饰有利于更好的理解纳米毒性的分子机制并提供纳米毒性的生物标志物分析。
2 材料和方法
2.1 银纳米颗粒的表征(AgNPs)
本研究中使用的两种类型的AgNPs ,主要区别在他们的表面化学成分。20nm 烃涂覆的AgNP 是用防止烧结的烃处理的,留下不均匀的烃表面层。多糖包被的AgNPs 是Dan Goia 博士((克拉克森大学,中心高级材料加工,波茨坦,纽约州))的慷慨礼物。使用多糖(阿拉伯胶)通过表面覆盖合成20nm 多糖包被的AgNPs 。使用透射电子显微镜(TEM )在Hitachi H-7600钨探针仪器上在100kV 的加速电压下表征溶液中的AgNP 的尺寸。将AgNP 以 1mg / ml浓度悬浮于去离子水中,然后使用Branson-1510超声波浴在室温下、35-40W 下超声处理15分钟,以帮助混合并形成均匀分散体。为了测量尺寸,将超声处理的1mg / ml AgNP 储备溶液稀释至50μg/ ml 工作溶液。在将NPs (纳米粒子)悬浮液沉积在碳膜包覆的铜网格中,之后检测AgNPs 尺寸。用于数字TEM 照相机的高级显微技术(AMT )软件被用于校准纳米颗粒的尺寸测量。信息处理使用点对点方法计算平均值和标准差[25]。结果显示AgNPs 的大小多数在5.0和20 nm之间(补充图1 a和b) 。多糖包被的纳米颗粒倾向于单独分布,而烃包被的颗粒趋向于聚集。
2.2。制细胞培养和AgNPs 治疗
J11细胞是彼得Stambrook 博士的礼物(辛辛那提大学医学院) 。将细胞在含有5%青霉素链霉素,1X 非必需氨基酸和1X 谷氨酰胺,10%胚胎干细胞限制性胎牛血清的DMEM 上培养,0.1μM 的巯基乙醇和50μM 抑制因子。在每个实验之前,用不含血清的细胞培养基(Ham's F12 / DMEM )制备AgNPs 溶液。将溶液在室温下在40W 下超声处理30分钟,以防止AgNPs 结块。将特定浓度的AgNPs (5
和50μg/ ml)加入到小鼠胚胎干细胞(60%混合)中,并在24,48和72小时收获细胞之前拍摄图像用于进一步分析。
2.3 活性氧(ROS)测定
处理和未经处理小鼠胚胎干细胞与5 μM CellROX 深红试剂在小鼠胚胎干细胞的细胞培养基中,黑暗条件下、37℃和10%CO 2的温育30分钟,并在PBS (pH
7.2-7.6)中洗涤3次。 CellROX Deep Red Reagent是一种细胞永久染料,吸收/发射最大值为644〜665 nm 。图像是用包括Fluoview 图像采集和分析软件的共焦显微镜(Olympus ,Cy5的信道)。
2.4.免疫印迹
将收获的对照和处理的小鼠胚胎干细胞用100μlRIPA 缓冲液溶解(Tris-HCl-pH7.4:50mM ,NP-40:1%,脱氧胆酸钠:0.25%,NaCl :150mM ,EDTA :1mM )。将裂解物以1000×g 离心1分钟,并向100μl 细胞裂解物中加入100μl2×染料。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离样品中的蛋白质, 然后转移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF ,Millipore )。在4℃下分别用Oct-4和Rb 一抗探测膜过夜,随后在各自的二抗中在室温下孵育1小时。使用具有X 射线胶片的非饱和曝光的化学发光技术,使条带可视化。抗β-肌动蛋白抗体作为上述所有抗体的上样对照。
2.5 流式细胞术
mESCs 用5和50μg/ ml多糖包被的和烃包被的AgNP 处理24和48小时。使用EZ-BrdU 细胞增殖试剂盒来测定对照组和处理组的mESC 中细胞周期阶段的变化。将BrdU 光聚合物加入AgNPs 处理的mESCs 中24小时,并检查每个时间点,然后根据制造商的方案进行进一步的实验程序。BrdU 处理后,使用0.25%胰蛋白酶收获细胞并离心5分钟。吸出上清液并将沉淀物轻轻地用洗涤缓冲液悬浮再离心。将沉淀物重新悬浮在70%(v / v)冰冷的乙醇中(细胞密度调节至1-2×10 6个细胞/ ml)并储存至少过夜或在-20℃下使用。向细胞沉淀中加入适量的荧光素-PRB1(5μl 抗-BrdU 和95μl 每次测定的漂洗缓冲液),重悬浮,并在室温下避光孵育60分钟。加入500μlPI / RNA酶A 溶液,在室温下避光孵育30分钟。使用BD FACSCalibur 流式细胞仪(BD 的FACSCalibur TM )用的FlowJo 染色(版本9)软件的在3小时内对细胞进行分析。在488nm 处激发细胞,并且使用合适的滤膜捕获BrdU-FITC 和在单独的通道中捕获PI 阳性信号。数据分析使用ModFit LT 3.1和细胞追求专业软件。
3结果
3.1 AgNPs制菌落形态学改变
使用两种不同的表面化学组成的AgNPs ,多糖包被的和烃包被的,测试它们对mESCs 自我更新和细胞增殖的影响。当mESCs 暴露于浓度为5μg/ ml 和50μg/ ml的多糖和烃包被的AgNPs 时,即使在低浓度(5μg/ ml)下,菌落也显示出具有平滑和粗糙边缘的不规则形态。这些形态对于正常mESCs 集落是非典型的。此外,许多菌落在处理后24小时开始分解并变成单一浮动细胞(图1a )。与多糖包被的AgNPs 相比,烃包被的AgNPs 处理后产生较低的单细胞群,表明多
糖涂层降低AgNPs 对mESC 的毒性
3.2 AgNPs增加mESCs 中的ROS 产生
为了探究AgNPs 的引起mESCs 应激的原因,将细胞暴露于5和50μg / ml多糖包被的AgNPs 和碳氢包被的AgNPs 。使用CellROX Deep Red试剂比较每种处理中的ROS 产生水平。染料在还原状态下显示非荧光,在活性氧物质被氧化时产生荧光,在665nm 最大值的发射波长下可以被检测通过荧光成像测量。当细胞暴露于AgNPs, 荧光强度增加, 这表明, 活性氧产量增加。如图2所示a 和c, mESC 在多糖包被的AgNPs 处理后,随着处理浓度从5μg/ ml增加至50μg/ ml,24小时内细胞中的红色荧光强度逐渐增加。另一方面手, 在5μg/ ml浓度下烃包被的AgNPs 产生比多糖包被的产生更强的红色荧光信号,但是在50μg/ ml 处理时荧光信号较弱,因为细胞死亡发生在该浓度的烃包被的AgNPs 实验(图2 b 和d) 。结果表明, 多糖包被减少ROS 生产。
3.3 AgNPs通过阻止视网膜母细胞瘤的磷酸化(Rb )阻止mESCs 细胞周期
研究表明AgNPs 改变mESCs 细胞周期分布。 在烃包被的AgNPs 处理后24小时(5μg/ ml ),在烃包被的AgNPs 处理后5小时(5μg/ ml ),与未处理的对照细胞相比,43.69%的mES 细胞处于G1期,0.00%处于S 期,56.31%处于G2期 23.19%的G1期细胞,59.73%的S 期和17.08%的G2期。48 h后,大部分细胞停滞在S 期(82%),16.3%的细胞处于G1期,仅有1.15%的细胞处于G2期。多糖包被与烃类包被的AgNPs 处理后的细胞(5μg/ ml )的细胞周期分布趋势类似,显示没有S 期活性(0.00%)和G1(45.1%)和G2(54.9%)。处理后48h ,大部分细胞停滞在S 期(79.54%)。G1期细胞的16.3%,只有1.15%的人G2期。这些结果表明两种AgNPs 在实验的第一个24小时诱导细胞周期滞留在G1检查点,大48小时后多数细胞滞留在实验的S 期(图3c 和d )。为了深入了解AgNPs 对mESCs 细胞周期影响的分子机制进展,通过蛋白质印迹检查Rb 蛋白磷酸化的状态。结果显示,与未处理的细胞mESCs 相比,两种AgNPs 在5μg/ ml消除Rb 的超磷酸化(图4a 和b )。Rb 蛋白的去磷酸化允许Rb 结合E2F 转录因子,停止细胞周期。Rb 的脱磷酸化与细胞周期研究相关,显示在24小时内G1 / S阻滞。此外,还有证据表明,在更长的温育后,5μg/ml的5kDa Rb 裂解带增加。 以前的研究表明,这种切割与凋亡有关。由于细胞死亡,Rb 水平在烃类包被的AgNPs50μg/ ml 处理下非常低。β-肌动蛋白负载控制的结果表明在该剂量的治疗中我们失去了大量的细胞。
3.4 AgNPs OCT4基因表达改变
众所周知Oct4是维持ES 自我更新和分化的主调节物。Oct4水平必须严格调节,以保持ESCs 的多能性。OCT4基因可以通过选择性剪接产生至少两个转录物(OCT4A ,OCT4B )。 OCT4A是负责ESCs 多能性的转录因子。相比之下,Oct4B 转录本没有外显子1被截断。因为Oct4B 不能维持ESCs 细胞自我更新,所以建议它可能负责细胞应激[23]。为了研究OCT4表达是否受AgNPs 暴露的影响,通过western 印迹分析Oct4蛋白表达。图5证明Oct4A 的蛋白水平降低,Oct4B 增加。此外,有多个较小的带,分子量约OCT4B-265,OCT4B-190,OCT4B-164
在AgNPs 实验中出现响应。这些数据提供了AgNP 诱导Oct4B 同种型OCT4B-265,OCT4B-190,OCT4B-164表达的证据。 在碳氢化合物包被的处理中观察到的较低密度同种型是由于更多的细胞经历凋亡。 进一步研究Oct4B 蛋白表达与不同AgNPs 涂层的相关性将提供关于纳米毒性机制和OCT4基因在干细胞应激反应中的作用的重要见解。
4讨论
AgNPs 由于其高的表面积与重量比而对生物分子高度反应,这使得它们在用于消费品和医疗设备中非常通用。其广泛的应用范围使它们高度暴露于人体和环境。我们的研究结果表明AgNPs 治疗引起增加ROS 水平和抵消对mESCs 自我更新和增殖的影响。从Rb 磷酸化获得的结果支持在G1/S转换的细胞周期停滞的猜想,因为它经历Rb 蛋白的高度磷酸化的减少。这项研究提供了洞察AgNPs 对干细胞自我更新和细胞周期进展的影响的分子机制。此外,还有以前的研究证据表明5 kDa Rb裂解带与凋亡有关[24]。与这种分裂相关的研究将继续。此外,为了更好地了解AgNPs 对干细胞自我更新的影响的分子机制,我们验证Oct4蛋白表达响应AgNPs 的实验。结果表明,当mESCs 暴露于AgNP 8小时,诱导Oct4B-265,OCT4B-190和OCT4B-164产生。 在暴露于电离辐射后4小时内观察到类似的同工型(数据未显示)。已经通过替代翻译和选择性剪接产生了同工型[21] 选择性翻译在蛋白质生产中产生了额外的复杂性和监管能力,蛋白质变异可能在功能和定位是不同的。我们的数据表明OCT4基因不仅在干细胞自我更新中发挥重要作用,而且还通过选择性剪接和翻译在维持干细胞的基因组稳定性和细胞命运中具有非常重要的作用。为由于应激响应,选择性剪接和翻译产生Oct4B 及其变体以预防干细胞更新并进行修复或细胞死亡程序。需要进一步的研究以通过鉴定调节选择性剪接和翻译调节所涉及的因子来测试该假说,并研究Oct4的每种同种型响应于应激的作用。研究将更好地了解Oct4的作用和干细胞如何应对压力的分子机制。 它还将为纳米颗粒的潜在毒性提供必要的科学数据。
总之,我们的研究表明AgNPs 可以诱导细胞周期滞留,改变细胞周期检验点蛋白表达和阻止干细胞自我更新。我们假设AgNPs 诱导ROS 生产,导致细胞不能维持正常的生理氧化还原调节功能。这可以导致改变基因表达和蛋白质修饰。 基于这一假设,AgNPs 的表面化学的修改可以减少ROS 生产,从而改变这些NPs 的毒性。我们的研究发现,多糖包被的纳米粒子毒性较小,因为它们倾向于单独分布,产生较少的ROS ,而烃包被的粒子趋向于聚集。总的来说,在我们的大多数研究中,似乎烃包被的AgNP 处理比多糖包被处理产生更大的毒性作用。 这可能是由于多糖包被干扰AgNP 和水之间的相互作用,降低了ROS 产生。 需要对这些颗粒的差异聚集或溶解效应的机理的进一步详细研究以更好地理解纳米颗粒的表面化学性质及其毒性效应的关系。