膜蛋白研究的里程碑
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第49卷 第5期 2004年3月
膜蛋白研究的里程碑
——2003年诺贝尔化学奖
赵文龙 隋森芳*
(清华大学生物科学与技术系,生物膜国家重点实验室,北京100084. * 联系人,E-mail: [email protected])
2003年10月, 诺贝尔化学奖颁给了两位生物学家, 美国约翰霍普金斯大学(Johns Hopkins University)医学院的Peter Agre和洛克菲勒大学(Rockefeller Uni-versity)休斯医学研究所(Howard Hughes Medical In-stitute)的Roderick Mackinnon, 以表彰他们“在膜通道研究领域上的一系列开创性的工作”. Agre的主要贡献是发现了细胞膜上水通道的存在; 而Mackinnon的主要贡献则是通过解析钾离子通道的三维空间结构阐明了该离子通道的机制.
外一个独立的研究小组通过放射性失活研究肾脏的水通透变化, 最后把目标指向一个大约为30 kD大小的蛋白. 由于该蛋白的特征性的组织分布, Agre开始意识到这个蛋白可能就是长期以来一直寻找的水通道蛋白.
这个蛋白现在被称作aquaporin1(AQP1). Agre设计了巧妙的实验, 在水通透性非常低的非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵中验证了AQP1的水通道蛋白的功能. 当爪蟾卵中注射有体外转录的AQP1 RNA后, 对水的通透性迅速升高, 将其置于低浓度外界溶液中时, 体积膨胀变形, 这一过程可被Hg2+可逆抑制[5]. 体外实验也支持这一结论, 把高纯度的AQP1重组到脂质体上后, 脂质体对水的通透性提高了50倍以上, 达到每个亚基每秒钟可以通过大约3×109个水分子, 而对质子和尿素的通透性并没有提高[6]. 更加直接的证据来自van Hoek, 他把除AQP1以外的其他蛋白去除掉以后, 红细胞仍然具有很高的水通透性[7]. 至此, 关于水通道存在性的争论告一段落. 目前的观点是细胞膜的脂双层可以透过一定量的水分子, 但要使水分子高效地透过细胞膜, 必须要水通道的参与.
AQP1以四聚体的形式存在于细胞膜中, 每个亚基都能形成功能上独立的孔道[8]. 序列分析表明, 它是一个6次跨膜的蛋白, N-端和C-端序列相似, 各具有一个保守的特征性序列Asn-Pro-Ala(NPA)(图1). AQP1具有4个半胱氨酸, 但突变研究表明, 仅仅一个(Cys-189)对汞离子敏感, 这个半胱氨酸靠近NPA序列, 位于水通道的孔道内. Agre通过重组技术在AQP1上引入特异性的酶切位点, 并用酶切分析揭示了它的拓扑学结构, 据此提出“砂漏模型(hourglass model)”. 这个模型认为:两个分别位于N-端和C-端包含NPA序列的螺旋从膜内外两侧朝膜中央伸展而重叠, 并形成一个被6次跨膜的螺旋所包围的孔道[11]. 这个模型是生化上对AQP1结构认识的一个总结.
由于肾脏与水的重吸收息息相关, 人们把分离水通道家族其他蛋白的目标指向了肾脏. 不久,
1 水通道(Aquaporins)的发现
水是生物体的主要组分, 生物体细胞吸收和释放水分是一个基本的生命现象. 长期以来, 关于水分
子如何穿过细胞膜一直存在着争议. 最早, 认为水分子是以自由扩散的形式透过细胞膜的, 然而许多实验室观察到了与此观点不太一致的一系列现象. 红细胞膜对水分子的通透率(permeability)比其他许多细胞和人工脂双层要高很多; 而且该过程的自由能很低, 只有21 kJ/mol, 相当于在溶液环境中自由扩散. 用HgCl2和一些有机汞试剂可以可逆地抑制这一过程, 提示了水分子的跨膜运输与蛋白质相关. 更进一步的证据来自某些上皮组织, 它们在显示出对水通透性的变化的同时, 脂类分子的组成和含量却没有改变. 这些事实逐渐使人们意识到, 在细胞膜上一定存在着专门运输水分子的通道, 这个通道对水有很高的通透效率. 然而由于水分子的通道蛋白一直没有被分离出来, 加上脂双层膜本身对水有一定的通透性, 所以水通道的存在性曾广受质疑[1].
直到20世纪80年代末, 一次偶然的机会, Agre发现了水通道. 他在分离Rh血型抗原中的32 kD大小的整合膜蛋白时, 得到了一个28 kD的肽段. 起初认为是Rh抗原裂解的小片段, 后来他发现这是一种新的蛋白, 这种蛋白主要分布在红细胞和肾小管细胞中, 并且以非糖基化的28 kD和N-糖基化的40~ 60 kD两种形式存在[2]. 通过序列的比较表明[3], 它与一组可能具有膜通道功能的蛋白很相似. 与此同时, 另
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图1 AQP1拓扑结构模式图
从图中可以看出, 水通道每个亚基有6个跨膜螺旋(H1~H6)及2个短螺旋(HB和HE). NPA序列就位于短螺旋的顶端.
灰色圆圈表示结构上比较重要的氨基酸[9]
AQP2, AQP3, AQP4等相继被分离出来. 到目前为止, 在人体内至少鉴定出11种水通道蛋白, 分布不再局限于肾脏, 在脑、眼、肝脏、唾液腺等其他器官中都发现了它们的存在[12]. 它们大体上可以分为两类: 一类是传统的水通道(classic aquaporins), 只选择性地透过水分子; 另一类则称为甘油水通道(aquagly- ceroporins), 可以让水和甘油等其他一些小分子通过. 这些水通道与许多人体疾病相关, AQP0基因突变可以引起先天性白内障(congenital cataracts)[13], AQP2基因突变则使得肾收集管重吸收功能受损, 从而导
水通道具有很强的选择性, 它可以让水分子穿过, 但对溶液里的阳离子和阴离子, 尤其是水合质子却没有通透性. 这个问题长期困扰着人们, 因为形成连续氢键的水分子可以以跳跃的方式极快地运输质子, 就好像电子通过铜导线. 水通道是如何快速运输水分子, 而不让质子通过的呢? 近年来, 通过电子晶体学(electron crystallography)和X射线衍射技术(X-ray crystallography)获得了水通道的高分辨率的三维结构[9,15], 再加上分子动态模拟(molecular dynamics simulation)的方法[16,17], 水通道的选择性运输机制才得以初步阐明.
每个水通道蛋白亚基具有一个砂漏状的孔道,
长度为20 Å. 整个孔道侧壁主要由疏水性氨基酸围成, 但也提供了4个亲水的位点, 利于水分子结合, 以降低水分子穿过孔道时的能量障碍. 这两种因素达成一种巧妙的平衡, 保证了水通道对水的极高的通透率和选择性[15]. 在孔道中点上方8 Å处, 直径最为狭窄, 此处可以通过大小限制(size restriction)和静电排斥作用(electrostatic repulsion)来选择水分子. 最窄处主要由精氨酸(Arg-195)和组氨酸(His-180)的侧链围成, 直径2.8 Å, 与水分子的范德华半径相似, 可以滤掉比水分子半径大的分子. 同时, 由于精氨酸电荷, 可以排斥阳离子, 紧密结合阴离子, 使它们无法穿过水通道. 在水通道里, 最引人注目的是NPA的特征性序列, 它在所有的水通道中都存在. 两个NPA序列结构通过范德华力并排地结合在孔道的中点处, 两个短的α-螺旋与NPA序列相连, 且N末端朝向孔道, 使得NPA上的天冬酰氨带上部分正电荷. 目前认为穿过水通道的水分子在此处与两个天冬酰氨形成临时氢键, 从而发生极性翻转(water dipole reorientation)——水分子进入孔道的胞外侧时氧原子朝下, 在到达胞质侧时氧原子变成朝上(图2), 其结果是打破水分子之间形成的连续氢键, 阻断质子 运输.
致肾性尿崩症(nephrogenic diabetes insipidus, NDI). (Arg-195)和组氨酸(His-180)在生理条件下都带有正
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图2 水通道选择通透机制
水分子在孔道中点处, 与两个天冬酰氨形成暂时的氢键, 发生极性翻
转[9], 从而打断连续氢键
2 钾离子通道(potassium channels)机制的阐明
钾通道的研究历史就比较久了, 大约在50年前, Hodgkin和Huxley(1963年诺贝尔生理学和医学奖得主)就阐明了神经的动作电位(action potential)机制, 指出神经细胞膜顺序性的对钠和钾离子通透性的升高是产生动作电位的原因. 这实际上就暗示了具有选择透性的离子通道(ion channels)的存在. 到了80年代, 各种电压门控离子通道的α 亚基相继被克隆出来[18]. 钠离子和钙离子通道的序列表明, 它们具有4个同源重复的6次跨膜(分别为S1~S6)结构域. 钾离子通道稍晚才得以克隆, 它的序列长度只有钠通道的四分之一, 仅具有一个6次跨膜的结构域. 因此, 钾通道应该是以同源四聚体(homotetramer)的形式存在. 这一点后来被Mackinnon用化学计量法证明[19].
电压门控钾通道的6个跨膜区中(图3(a)), S1~S4被认为是感受电压的部位, 尤其是S4, 分布着带正电的氨基酸. 其中前4个精氨酸构成主要的感受部位[21], 在电场的作用下, 可以在膜的两侧移动以控制通道的开闭. S5和S6是钾离子选择性通透的部位,
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它们之间的短的孔道螺旋(pore helix)和非常保守的特征性序列(signature sequence)在执行选择性的功能上起重要作用[23]. 然而并不是所有的钾通道都是6次跨膜, 还有一类钾通道2次跨膜, 序列分析结果显示, 这类钾通道的两个跨膜区与电压门控的钾通道的S5和S6是同源的, 且具有相同的功能.
长期以来, 人们通过电生理、生物物理、突变等多种手段对这些分子的通透机制等进行了大量的研究, 在钾离子通道不同功能区的定位方面取得了长足的进展, 到了90年代中期, 钾离子通道的选择性功能已经定位到通道的外侧一个保守性非常强的区域. 然而, 只有通过分析原子分辨率的结构, 才能真正地了解钾离子通道的选择性通透机制、打开和关闭通道即门控机制以及电压感受机制等一系列基本问题. 由于钾离子通道原子水平的三维结构一直无法取得, 人们对这些基本问题的理解仍十分有限. 直到1998年, Roderick Mackinnon才成功解出第一个高分辨率的离子通道三维空间结构──源自链霉菌Streptomyces lividans的KcsA钾离子通道(图3(a)), 这个结构一定程度上解释了钾离子通道的选择性通透机制. KcsA每个亚基具有两个跨膜区和一个短的孔道螺旋, 其中一个跨膜螺旋靠近中央孔道(内螺旋, inner helix) , 另一个与膜脂相邻(外螺旋, outer helix). 内螺旋与膜垂直方向形成25°左右的夹角, 且轻度扭结. 4个亚基围成一个横跨细胞膜的孔道, 孔道在细胞膜的外侧部分是由特征性序列所组成的选择性过滤器(selectivity filter), 孔径狭窄,孔道的其他部分则比较宽, 在通道中央形成一个直径为10 Å的中央腔(central cavity). 靠近细胞膜的胞质一侧, 4个内螺旋末端形成束状. 除了KcsA的结构外, Mackinnon相继解出了钙离子门控的钾通道、电压门控的钾通道等一系列离子通道的结构(表1). 结合一系列功能性实验, 许多离子通道的基本活动机制得以阐明.
最先得到阐明的是钾离子通道的选择性通透机制(selective conduction). 对钾离子的选择性通透发生在选择性过滤器. 在过滤器里, 由特征性序列苏氨酸-缬氨酸-甘氨酸-酪氨酸-甘氨酸组成的肽段提供的羰基指向孔道中央, 形成了由氧原子构成的4个沿着孔道排列的“笼子”, 每个笼子可以容纳一个钾离子(图3(b)). 钾离子在溶液中以水化状态存在, 结合着8个水分子. 一旦钾离子进入到过滤器里, 它便去水化,
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图3 钾离子通道结构
(a) KcsA三维结构. 它由4个亚基围成一个通过钾离子的孔道, 为了观察方便, 前面靠近观察者的亚基被去除掉. KcsA具有两个跨膜螺旋, 相当于6次跨膜的钾离子通道的S5和S6跨膜区. 图中,HO和HI分别表示外螺旋和内螺旋,P为孔道螺旋,CC为中央腔,SF代表选择性过滤器. (b) 选择性过滤器处的电子密度显示了钾离子的位置:钾离子位于1, 3位置或处在2, 4位置. 空心圆圈代表钾离子, 实心圆圈表示水分子, 可以看到
钾离子“排队”穿过钾离子通道[20]
表1 Mackinnon在离子通道结构方面的主要贡献
结构名
PDZ结构域(来自PSD-95)
KcsA(来自Streptomyces Lividans的钾离子通道)[23]
真核PAS结构域(来自HERG电压门控钾通道的N端结构域)[25]Kvβ 2的β 亚基
[26]
[27]
[24]
文献出处 Cell, 1996 Science, 1998 Cell, 1998 Cell, 1999 Science, 2000 Neuron, 2001 Nature, 2001b Nature, 2002
[30,31]
[28]
Kv1.1的T1结构域与Kv β 2 蛋白的β 亚基形成的复合物RCK结构域(来自大肠杆菌的6次跨膜钾通道)KcsA-Fab复合物ClC氯离子通道
[20][29]
MthK(来自Methanobacterium thermoautotrophicum的钙离子门控的钾通道)G蛋白门控的内向整流钾通道GIKR1的胞质结构域大肠杆菌ClC-Fab复合物
Nature, 2002a, 2002b
Cell, 2002 Nature, 2003 Science, 2003
[32]
[33]
KvAP(来自Aeropyrum pernix)-Fab复合物以及电压感受桨-Fab复合物
[34]
换之以结合位点处上方和下方各4个来自通道蛋白的羰基氧原子. 这种结合位点处氧原子的排列模拟了水化的钾离子周围水分子的氧原子排列, 因此钾离子从水溶液进入到选择性过滤器去水化所消耗的能量在很大程度上可以得到补偿. 而钠离子的离子半径(0.95 Å)比钾离子(1.33 Å)要小, 故与过滤器的氧
原子排列不匹配, 使得钠离子通过钾离子通道时难以去水化, 具有较大的能量障碍.
钾通道的通透率很高, 达到108个/s, 和水通道一样, 钾离子通道也有一系列的机制保证钾离子快速通透. 钾离子通道有一个宽大中央腔, 可以容纳较多的水分子, 使得钾离子可以以水化离子的形式
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存在于中央腔中, 故比较稳定. 中央腔顶端有孔道螺旋, 它的C-末端朝向中央腔且带部分负电荷, 可以吸引带正电的钾离子. 这种孔道螺旋的结构在许多离子通道中普遍存在, 在氯离子通道里, 就有许多短的螺旋的带正电端朝向孔道. 除了结构上的研究外, 通过对其他离子(Rb+)在选择性过滤器分布的比较研究表明[35], 选择性过滤器同时有两个钾离
随着钾离子通道选择性通透机制和门控机制相继被揭开, 电压感受机制成为下一个急需解决的问题, 这个问题是钾离子通道中最难以解决也是最重要的问题之一. Mackinnon在经过6年的努力后, 终于在2003年发表了第一个6次跨膜的电压门控钾通道(voltage-gated potassium channel)的结构[33]. 这个结构模型来自于嗜热细菌Aeropyrum pernix的电压门控
的钾通道KvAP, 虽然这个结构被认为处于非天然状子存在, 它们之间距离在7.5 Å左右, 这相当于
态, 但它还是为我们理解电压感受机制提供了大量4 mol/L KCl中的钾离子的平均距离, 因此相互之间斥力很大, 这种斥力有利于钾离子的快速通透.
通过KcsA的结构, 我们看到了一个关闭着的钾通道, 然而关于钾离子通道是如何开闭的, 却没法回答. 2002年, Mackinnon成功地得到了MthK的结构, 通过与KcsA的结构进行比较, 钾离子通道的门控机制得以阐明. KcsA的结构代表了关闭的钾通道, 而MthK, 这个来自甲烷细菌(Methanobacterium ther-moautotrophicum)的钙离子门控钾通道在钙离子浓度较高的条件下结晶, 是处于开放的状态. 将两者的结构进行比较, 我们可以推测出钾离子通道在开闭时构象的变化. 关闭时, 钾离子通道4个亚基的内侧螺旋伸直, 在细胞膜的内表面形成束状. 这个束状孔道的直径最窄处仅3.5 Å, 且分布有较多的疏水氨 酸, 使得钾离子无法透过. 通道打开以后, 它的选择性过滤器没有发生构象变化, 而围着中央腔的内侧螺旋产生了约30°的外弯而打开, 使直径达到12 Å, 从而钾离子可以在通道的中央腔和胞质之间自由扩散. 这个弯曲点即门控转轴(gating hinge), 对应于MthK的甘氨酸-83和KcsA的甘氨酸-99(图4). 由于甘氨酸可以选取的主链的二面角范围比较大, 因而柔性比较强, 是非常适合作为门控转轴的.
直观信息.
KvAP的结构表明, S3跨膜螺旋实际上被一个小 环分成了两段, 即S3a和S3b. S3b和S4结合在一起,形成螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix)的紧密结构. 这个结构含有大量的疏水氨基酸和一些带正电荷的氨基酸, 可以在膜电压变化时在膜中来回移动, 被称为电压感受桨(voltage-sensor paddle). 电压感受桨主要依靠前4个精氨酸感受电压变化, 在膜中移动, 再通过S4-S5的连接部位, 造成通道的开和闭(图4). Mackinnon实验室[36]进一步用分子尺(molecular ruler)的方法, 测得电压感受桨在细胞膜垂直方向上的移动距离在20 Å左右.
3 小结
可以说, Agre和Mackinnon的出色工作分别解决了水通道和钾通道研究中的瓶颈. Agre关于水通道发现的最重要的工作于1988年就完成了, 尽管后来阐明水通道通透机制的高
分辨结构并不主要由Agre完成, 但由于他首先发现并证明了水通道的存在, 使得水通道的研究在全世界迅速开展起来, Agre因此而获得了诺贝尔奖殊荣. 钾通道研究所遇到的困难与水通道截然不同. 钾离子通道很早就被人
图4 推测的打开和关闭状态的电压门控钾通道
电压感受桨伸向通道外围, 由S3b-S4组成, S6上箭头所指的点表示门控转轴, 这里S5, S6的在开闭时的位置是依据KcsA和MthK的三维结构来确
定的. 从图中可以看到, 电压感受桨感受电压的变化, 从细胞膜内侧向外侧移动, 牵动钾离子通道的开放[36]
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推测并证明其存在, 但始终缺少原子结构来解释通道机理. 就在这种大背景下, Mackinnon毅然转向结构生物学来研究钾通道. 从1998年开始, 通过一系列结构的解析, 他成功地建立了钾离子通道(也包括氯离子通道)较为完整的模型. Mackinnon获得诺贝尔奖也是实至名归.
致谢 感谢Yoshinori Fujiyoshi和Roderick Mackinnon分别提供了图1, 2和图3(b), 4, 所有这些图片都取得了Nature出版集团的使用授权.
参 考 文 献
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