人外周血内皮祖细胞的分离.培养.扩增和鉴定

　　[摘要]目的：研究人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定方法。方法：采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，用EGM-2培养基在多聚赖氨酸包被的培养板中进行诱导培养，动态地观察贴壁细胞的生长状况，免疫组织化学技术检测培养细胞表面标志物的表达。结果：人外周血单个核细胞经体外培养至第2天，呈贴壁生长，细胞形态为大小相近的圆球体；第4天一些细胞开始出现尾状物，形态呈蝌蚪样改变，部分细胞聚集形成细胞簇；至第7天细胞形态变长，呈梭形改变，细胞间相互围绕呈环形，并有集落出现，免疫组织化学染色CD133、CD34、VEGFR-2和Ⅷ因子表达均呈阳性。结论：运用本实验方法可以成功实现人外周血内皮祖细胞的分离、培养和扩增。　　[关键词]内皮祖细胞；外周血；细胞培养　　[中图分类号]Q813.1 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）08-1318-03　　内皮祖细胞（Endothelial Progenitor Cells， EPCs）是血管内皮细胞的前体细胞，亦称血管母细胞（angioblast），EPCs不仅参与胚胎血管生成，而且也参与出生后的血管新生过程。近些年来人们对EPCs在血管形成、心脑血管疾病和创伤愈合等方面的作用进行了广泛的研究[1]，EPCs移植技术已成为治疗心脑血管疾病的一种新兴的方法[2]，具有广阔的临床应用前景。但由于EPCs的来源有限，目前的培养方法尚不能满足基础研究和临床治疗的需要，在本实验中，笔者研究从来源相对广泛的人外周血中分离培养EPCs，为EPCs的应用提供一种便捷有效的分离方法。　　1 材料和方法　　1.1 材料：主要试剂和仪器：内皮细胞培养基（Endothelial Cell Growth Medium-2，EGM-2）（Lonza公司）。人淋巴细胞分离液（天津灝洋生物制品有限公司）。鼠抗人CD133单克隆抗体、血管内皮生长因子受体2（Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2，VEGFR-2）（北京博奥森生物技术有限公司）。鼠抗人CD34单克隆抗体、Ⅷ因子、鼠兔通用型二抗、浓缩型二氨基联苯胺（Diaminobenzidine， DAB）试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。多聚赖氨酸、多聚甲醛（Sigama公司）。Olympus倒置显微镜（日本）。　　1.2 方法　　1.2.1 人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC）的分离：采集健康人外周血30ml，肝素抗凝后用（Phosphate Buffer Saline，PBS）稀释（1：1），稀释液沿试管壁缓慢加入到人淋巴细胞分离液（Ficoll）液面上（血液与Ficoll体积比为2：3），然后将其放到水平离心机内以2000r/min速度离心20min。离心后液体从上到下被分为四层，依次为血浆层，单个核细胞层，淋巴细胞分离液层，红细胞层。吸取单个核细胞层后加入等体积含有2%胎牛血清的PBS，以1 000r/min速度离心10min，弃上清液，离心两遍，清洗两遍。　　1.2.2 细胞的培养和扩增：将分离出的细胞以10×106个细胞/孔接种于经多聚懒氨酸包被的六孔板中，在温度为37℃、二氧化碳体积分数为5%、湿度≥95%的条件下，用EGM-2培养基（含胎牛血清、VEGF、青霉素和链霉素）培养，隔天换液，换液后用倒置显微镜观查细胞的生长状况，并照相。　　1.2.3 细胞表面标志物的检测：细胞培养至第7天后用洗掉非贴壁细胞，留下的贴壁细胞用胰酶消化，消化完成后加完全培养基终止，吸取细胞液以1 000r/min速度离心10min。将离心后的细胞加培养基混匀，然后滴加到培养皿内的细胞贴片上，让细胞贴片30min后，在培养皿内轻轻的添加完全培养液，放于温度为37℃、二氧化碳体积分数为5%、湿度≥95%培养箱中培养至细胞爬满爬片。运用二部法免疫组化检测细胞表面标志CD133、CD34、血管内皮生长因子受体2（VEGFR-2）和Ⅷ因子的表达，并设阴性对照组加以对比。　　2 结果　　3 讨论　　内皮祖细胞不仅参与胚胎组织血管化和出生后的血管生成，还参与机体器官损伤后的血管再生与修复，在缺血性疾病、预防血管再狭窄、血管创伤愈合等过程中具有重要的治疗作用[3]。1997年，Asahara等[4]首先发现在循环外周血中存在能分化为血管内皮细胞的前体细胞，并将其命名为血管内皮祖细胞（EPCs），此后，人们发现骨髓和脐血中也存在EPCs，而且含量远多于外周血。尽管如此，由于人外周血较骨髓和脐血取材相对便利且用量易于控制，使外周血分离培养EPCs成为EPCs应用研究中的可靠获取途径。　　生理状态下，成人EPCs主要存在于骨髓内，外周血中含量低，传统采用包被抗CD34、VEGFR2或CD133抗体的免疫磁珠分选法进行筛选、分离EPCs。由于EPCs特异性表面标志物缺乏，因此通过抗体的免疫磁珠筛选出的EPCs纯度高，但数量少[5]。此外，免疫磁珠分选法的技术难度大、价格也比较昂贵。为增加实验用EPCs的数量，本实验利用密度梯度离心法将外周血液中的EPCs进行富集，将富集的EPCs与其它单核细胞一并放入EGM-2培养基中，该培养基中有预先包被多聚懒氨酸的六孔培养板和多种内皮生长因子，对外周血中的单核细胞进行诱导分化培养，利用EPCs的细胞贴壁特性，在换液过程中将培养基中其它单核悬浮细胞去除，贴壁单个核细胞在特定培养基的选择诱导作用下得以分化生长。　　研究结果显示，悬浮的混杂细胞在换液过程被去除后，贴壁细胞在特殊培养基中培养、诱导、分化下迅速增殖，呈簇状生长，并形成集落，许多细胞聚集呈现大小不一的圆环状分布，并随培养时间延长，表现越发明显。笔者分析，EPCs圆环状生长，可能是其向内皮细胞方向分化过程中的一个特征性表现，通过圆环状分布有利于血管内皮细胞彼此间连接，最终形成血管，这是否能成为内皮细胞系细胞区别于其他细胞的一个生长特征，值得笔者进一步研究。 　　实验中笔者还发现，不同培养时间的EPCs形态差别较大，单靠形态难以鉴定EPCs。目前，EPCs的鉴定仍然要通过表面标志物检测，常以CD34、CD133、血管内皮生长因子受体2和Ⅷ因子作为识别EPCs的重要表型特征，具备上述表型特征的细胞方被认为是EPCs[6]。CD34是造血干细胞的重要标志，在胚胎早期血管就有表达，外周血中分离出的CD34阳性细胞在体外能够向内皮细胞分化在体内能够参与新生血管形成，因此常被用作识别EPCs的重要标志[7]。近年，更多研究表明，CD133能表达于EPCs上，是一种比CD34更有价值的EPCs表面标志，而且CD133在EPCs的分化过程中迅速下调，但在成熟内皮细胞则无表达，这使越来越多的学者乐于采用CD133来分离EPCs，并成为排除成熟内皮细胞的EPCs的细胞标记，进而成为分离EPCs的最常用细胞表面标志[8]。　　本研究中，笔者采用设立阴性对照的方法，对培养第7天的贴壁细胞进行免疫组化检测。结果显示，培养细胞的CD34、CD133、VEGFR-2和Ⅷ因子的几项检测指标在对照组为阴性，在试验组均呈阳性，表明笔者培养的细胞为EPCs。　　综上所述，本研究初步建立了一种人外周血EPCs的分离、培养方法，可避免人外周血EPCs较少，提取大量细胞困难的缺点，为后续实验研究提供充足的EPCs。　　[参考文献]　　[1]Singh AK，Gudehithlu KP，Patri S，et al.Impaired integration of endothelial progenitor cells in capillaries of diabetic wounds is reversible with vascular endothelial growth factor infusion[J]. Trans Res，2007，149 （5）：282-291.　　[2]Chen ZZ，Jiang XD， Zhang LL，et al.Beneficial effect of autologous transplantation of bone m arrow stromal cells and endothelial progenitor cells on cerebral ischemia in rabbits[J].Neurosci Lett，2008，445（1）：36-41.　　[3]Zhu C，Ying D，Mi J，et al.Development of anti-atherosclerotic tissue-engineered blood vessel by A20-regulated endothelial progenitor cells seeding decellularized vascular matrix. Biomaterials[J].Biomaterials，2008，29（17）：2628-2636.　　[4]Asahara T，Mumhara T，Suilivan A，et al.Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesi[J].Science，1997，275（5302）：964-967.　　[5]Boyer M，Townsend LE，Vogel LM，et al.Isolation of endothelial cells and their progenitor cells from human peripheral blood[J].J Vasc Surg，2000，31（1）：181-189.　　[6]Liu P，Zhou B，Gu D，et a.l.Endothelial progenitor cell therapy in atherosclerosis： a double-edged sword[J].Ageing Res Rev，2009，8（2）：83-93.　　[7]Devanesan AJ，Laughlan KA，Girn HR，et a.l.Endothelial progenitor cells as a therapeutic option in peripheral arterial disease[J].Eur J Vasc Endovasc Surg， 2009，38（4）： 478-481.　　[8]Fadini GP，Coracina A，Baesso I，et al. Peripheral blood CD34+KDR+ endothelial progenitor cells are determinants of subclinical atherosclerosis in a middle-aged general population[J].S troke，2006，37（9）：2277-2282.　　[收稿日期]2012-04-09 [修回日期]2012-06-25　　编辑/张惠娟