生物工业菌种与种子的扩大培养

第四章 生物工业菌种与种子的扩大培养

第一节 工业微生物菌种的衰退、复壮与保藏

一、微生物菌种的衰退

⒈ 菌种衰退的原因

菌种衰退的原因有两个方面：一是菌种保藏不妥；二是菌种生长的条件要求没有得到满足，或是遇到不利的条件，或是失去某些需要的条件。此外还有经诱变得来的新菌株发生回复突变，从而丧失新的特征等情况。

菌种连续传代是菌种发生衰退的直接原因。由于连续传代使菌种经常处于旺盛的生长状态，且每次传代时营养和环境等培养条件都是在不断地变化，与处于休眠状态的菌种相比，细胞的自发突变率要高得多。因此，菌株经过连续传代后，含突变基因的个体在数量上逐渐占优势，退化现象就逐渐显露出来。

⒉ 菌种性能的改变

⑴ 菌种遗传特性的改变 从菌种遗传机理这一微观角度来看，菌种遗传特性的改变主要有如下三个原因。

① 异核现象导致微生物群体发生变异。

② 自发突变导致菌种遗传特性改变。

③ 突变所产生的变种或杂交重组所形成的杂种往往不稳定，容易发生回复突变或产生分离子，以致在菌种这一群体中形成具有不同基因型（亦称遗传型）的个体。

⑵ 菌种生理状况的改变

⒊ 防止菌种衰退的措施

⑴ 菌种的分离

⑵ 菌种的复壮

狭义的复壮指的是菌种已经发生衰退后，再通过纯种分离和性能测定等方法，从衰退的群体中找出尚未衰退的少数个体，以达到恢复该菌种原有典型性状的一种措施。而广义的复壮应该是一种积极的措施，即在菌种的生产性能尚未衰退前就经常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，使菌种的生产性能逐步提高，所以，这实际上是一种利用自发突变(正突变) 从生产中不断进行选种的工作。

⑶ 提供良好的环境条件

⑷ 用优良的保藏方法

⑸ 定期纯化菌种

二、菌种的复壮

⑴ 纯种分离 ⑵ 通过寄主体进行复壮 ⑶ 淘汰已衰退的个体

三、菌种的保藏

⒈ 菌种保藏的原理

⒉ 菌种保藏方法

⑴ 斜面低温保藏法 ⑵ 液体石蜡封存保藏法 ⑶ 固体曲保藏法 ⑷ 砂土管保藏法 ⑸ 冷冻干燥法 ⑹ 液氮超低温保藏法

⒊ 菌种保藏的注意事项

⑴ 菌种在保藏前所处的状态 ⑵ 菌种保藏所用的基质 ⑶ 操作过程对细胞结构的损害

第二节 工业微生物菌种的选育

一、自然选育

自然选育包括从自然界分离获得菌株和根据菌种的自发突变进行筛选而获得菌种。 ⒈ 从自然界分离获得菌株

从自然界分离新菌种一般包括以下几个步骤：采样、增殖培养、纯种分离和性能测定等。 ⒉ 从自发突变体中获得菌株

二、诱变育种的程序

诱变育种的主要环节是：① 以合适的诱变剂处理大量而均匀分散的微生物细胞悬浮液(细胞或孢子) ，以引起绝大多数细胞致死的同时，使存活个体中DNA 碱基变异频率大幅度提高；② 用合适的方法淘汰负变异株，选出极少数性能优良的正变异株，以达到培育优良菌株的目的。

⒈ 出发菌株的选择

⒉ 菌悬液的制备

⒊ 前培养

⒋ 诱变

能诱发基因突变并使突变率提高到超过自然突变水平的物理化学因子都称为诱变剂。可分为物理诱变剂和化学诱变剂两大类。

⒌ 变异菌株的分离和筛选

三、诱变育种方案设计

㈠ 突变的诱发

诱变剂所造成的DNA 分子的某一位置的结构改变称为前突变。前突变可以通过影响DNA 复制而成为真正的突变，也可以经过修复重新回到原有的结构，即不发生突变。

⒈ 诱变剂接触DNA 分子

⒉ DNA损伤的修复

DNA 损伤的修复和基因突变有着密切的关系。已发现微生物有五种修复DNA 损伤方式，它们是：光复活作用、切补修复、重组修复、SOS 修复系统、DNA 多聚酶的校正作用。 ⒊ 从前突变到突变

⒋ 从突变到突变表型

突变基因的出现并不等于突变表型的出现，表型的改变落后于基因型改变的现象称为表型迟延。表型迟延有两种原因：分离性迟延和生理性迟延。

⑴ 分离性迟延 分离性迟延实际上是经诱变处理后，细胞中的基因处于不纯的状态(野生型的基因和突变型的基因并存于同一细胞中) ，突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达，需经过复制、分离，在细胞中处于纯的状态(一细胞中只有突变型基因，没有野生型基因) 时，其性状才得以表达。

⑵ 生理性迟延 突变基因由杂合状态变为纯合状态时，还不一定出现突变表型，新的表型必须等到原有基因的产物稀释到某一程度后才能表现出来。

㈡ 诱变剂的种类及选择

⒈ 诱变剂

⒉ 影响诱变效果的因素

㈢ 出发菌株的选择

① 选择纯种作为出发菌株，借以排除异核体或异质体（表型相同，基因型不同）的影响。 ② 选择出发菌株，不仅是选产量高的，还应该考虑其他因素。

③ 选择对诱变剂敏感的菌株作为出发菌株，不但可以提高变异频率，而且高产突变株的出现率也大。

㈣ 筛选的方法

⒈ 制定筛选方案

⒉ 营养缺陷型的筛选方法

营养缺陷型（auxotroph ）是指原菌株由于发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺陷，从而丧失了合成某些物质的能力，必须在培养中外源补加该营养物质才能生长的突变型菌株。原养型（prototroph ）一般指营养缺陷型突变株经回复突变或重组后产生的菌株，其营养要求在表型上与野生型（wild type）相同，如能在基本培养基（MM ）上生长，但基因型不一定相同。

⒊ 突变株的筛选

① 初级代谢产物高产菌株的筛选。根据代谢调控的机理，氨基酸、核苷酸、维生素等小分子初级代谢产物的合成途径中普遍存在着反馈阻遏或反馈抑制，这对于生产菌本身是有意义的，因为可以避免合成过多的代谢物而造成能量的浪费。

Ⅰ 降低终产物浓度

(a) 筛选终产物营养缺陷型 假设所需要的发酵产物是C ，而该生物合成途径的终产物是E ，则可筛选E 的营养缺陷型；如果营养缺陷型是由C→D的代谢被阻断，则可解除终产物E 对发酵产物C 合成的反馈阻遏或反馈抑制，而积累大量的发酵产物C 。

图 在简单的代谢途径中积累中间产物

(b) 筛选细胞膜透性改变的突变株 使之大量分泌排出终产物，以降低细胞内终产物浓度，从而避免终产物反馈调节。

Ⅱ 筛选抗反馈突变菌株

(a) 筛选结构类似物(抗代谢物) 抗性突变株

(b) 利用回复突变筛选抗反馈突变菌株

经诱变处理出发菌株，先选出对产物敏感的营养缺陷型，再将营养缺陷型进行第二次诱变处理得到回复突变株。

② 次级代谢产物(主要是抗生素) 高产菌株的筛选。

初级代谢与次级代谢都受到核内遗传物质的控制，次级代谢产物的合成同时还受到核外遗传物质——质粒的控制，有人将这种代谢产物叫做质粒产物。

(a) 利用营养缺陷型筛选。抗生素产生菌的营养缺陷型大多为低产菌株，但是如果某些次级代谢和初级代谢处于同一分枝合成途径时，筛选初级代谢产物的营养缺陷型常可使相应的次级代谢产物增产。

渗漏缺陷型(leaky mutant)是遗传性障碍不完全的营养缺陷型。

(b) 筛选负变株的回复突变株。

(c) 筛选去磷酸盐调节突变株。磷酸盐对许多抗生素的生物合成有抑制作用，筛选去磷酸盐调节突变株对于生产抗生素是很有意义的。

(d) 筛选去碳源分解代谢调节突变株。能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用时，往往对许多其他代谢途径中的酶(包括许多抗生素合成酶和其他的酶) 有阻遏或抑制作用，成为抗生素发酵产量的限制因素，不利于发酵生产工艺的控制。

(e) 筛选氨基酸结构类似物抗性突变株。许多抗生素和氨基酸有共同的前体或者有些氨基酸本身可以作为某些抗生素的前体。

(f) 筛选二价金属离子抗性突变株。加入能和产物(抗生素) 或其中间体结合的生长抑制剂(二价金属离子) ，抑制剂达到一定浓度，抗生素低产菌株不能生长而高产菌株能够幸存下来，

因而可能筛选到高产菌株。

(g) 筛选前体或前体结构类似物抗性突变株。前体或前体结构类似物对某些抗生素产生菌的生长有抑制作用，且可抑制或促进抗生素的生物合成。筛选对前体或前体结构类似物的抗性突变株，可以消除前体结构类似物对生产菌的生长及其抗生素合成的抑制作用，提高抗生素产量。

(h) 筛选自身所产的抗生素抗性突变株。某些抗生素产生菌的不同生产能力的菌株，对其自身所产的抗生素的耐受能力不同，高产菌株的耐受能力大于低产菌株。因此，可用自产的抗生素来筛选高产菌株。

㈤ 突变基因的表现

第三节 生产菌种的改良

杂交育种一般指两个不同基因型的菌株通过接合或原生质体融合使遗传物质重新组合，再从中分离和筛选出具有新性状的菌株。杂交育种是选用已知性状的供体菌株和受体菌株作为亲本，把不同菌株的优良性状集中于组合体中。因此，杂交育种具有定向育种的性质。

一、常规的杂交育种

常规的杂交育种不需用脱壁酶处理，就能使细胞接合而发生遗传物质重新组合。 ⒈ 遗传标记

杂交育种所用的亲本菌株通常要有一定的遗传标记以便于筛选。

⒉ 异核体形成

⒊ 杂合二倍体的形成

⒋ 染色体交换和单倍化

二、原生质体融合

原生质体融合一般包括标记菌株的筛选、原生质体的制备、原生质体的融合、融合子的选择、实用性菌株的筛选等。图为原生质体融合的基本过程示意图。

图2 原生质体融合的基本过程

原生质体融合过程如下。

⒈ 标记菌株的筛选

供融合用的两个亲株要求性能稳定并带有遗传标记，以利于融合子的选择。采用的遗传标记一般以营养缺陷型和抗药性等遗传性状为标记。

⒉ 原生质体的制备

原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存，在低渗透压溶液中，原生质体将会破裂而死亡。

⒊ 原生质体的融合与再生

检查原生质体形成和再生的指标有两个，即原生质体的形成率和原生质体的再生率。

⒋ 融合子的选择

融合子的选择主要依靠两个亲本的选择性遗传标记，在选择性培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。

⒌ 灭活原生质体融合技术在育种中的应用

三、DNA 重组技术

㈠ DNA重组过程

重组DNA 技术一般包括四步，即目标DNA 片段的获得、与载体DNA 分子的连接、重组DNA

分子引入宿主细胞及从中选出含有所需重组DNA 分子的宿主细胞。作为发酵工业的工程菌在此四步之后还需加上外源基因的表达及稳定性的考虑。

㈡ 分子育种技术

第五节 种子的扩大培养

一、种子扩大培养的任务

菌种扩大培养的目的就是要为每次发酵罐的投料提供相当数量的代谢旺盛的种子。

二、种子制备的过程

霉菌、放线菌的种子制备一般包括两个过程，即在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备和在液体培养基中生产大量菌丝的种子制备过程。

放线菌发酵生产的工艺过程如下：

菌种进入种子罐有两种方法。一种为孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子罐。此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成为发酵生产的一个方向。另一种方法为摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间。 ⒉ 种子制备

种子制备是将固体培养基上培养出的孢子或菌体转入到液体培养基中培养，使其繁殖成大量菌丝或菌体的过程。

三、种子培养

⒈ 表面培养法

⒉ 固体培养法

固体培养又分为浅盘固体培养和深层固体培养，统称为曲法培养。

⒊ 液体深层培养

液体深层种子罐从罐底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成微小气泡以促进氧的溶解。 深层培养基本操作的三个控制点

① 灭菌 发酵工业要求纯培养，因此在种子培养前必须对培养基进行加热灭菌。

② 温度控制 培养基灭菌后，冷却至培养温度进行种子培养，由于随着微生物的生长和繁殖会产生热量，搅拌也会产生热量，所以要维持温度恒定，需在夹套中或盘管中通冷却水循环。 ③ 通气、搅拌 空气进入种子罐前先经过空气过滤器除去杂菌，制成无菌空气，而后由罐底部进入，再通过搅拌将空气分散成微小气泡。

四、种子质量的控制

㈠ 影响孢子质量的因素及其控制

⒈ 培养基 ⒉ 培养温度和湿度 ⒊ 培养时间和冷藏时间 ⒋ 接种量

㈡ 影响种子质量的因素及其控制

⒈ 培养基 ⒉ 培养条件 ⒊ 种龄 ⒋ 接种量 ⒌ 种子质量标准

⒍ 种子异常的分析

种子异常往往表现为菌种生长发育缓慢或过快、菌丝结团、菌丝粘壁三个方面。