脂蛋白测定
实验三 血清（血浆）脂蛋白的测定
在脂蛋白中既有蛋白质又有胆固醇，还有磷脂的复合体，较难定量。由于其中的胆固醇含量较为稳定，因此目前以测定脂蛋白中胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据，即测定HDL 、LDL 或VLDL 中的胆固醇，并分别称为高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C ）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C ）或极低密度脂蛋白-胆固醇（VLDL-C ）。
磷钨酸-镁沉淀法测定高密度脂蛋白-胆固醇
测定血清HDL-C 时，通常需根据各种蛋白的密度、颗粒大小、电荷等，采用超速离心法、色谱法、电泳法、化学或免疫沉淀法将HDL 与其他脂蛋白分离开，然后测定HDL 组分中胆固醇的含量。美国疾病控制与预防中心（CDC ）测定HDL-C 的参考方法为超速离心法。此法主要用于靶值的确定及各种HDL-C 检测方法学评价，但因需特殊仪器，对技术操作要求高，一般实验室难以开展。色谱法和电泳法因仪器、操作要求高等种种原因临床常规实验室也较少应用，多用于脂蛋白的研究。
临床实验测定HDL-C 的方法大致分为以下三类。第一类为化学沉淀法。常用的沉淀剂为聚阴离子/多阴离子，如磷
钨酸（PTA ）、硫酸葡聚糖（DS ）、肝素或非离子多聚体如聚乙二醇（PEG ）与某些两价阳离子（Mg 、Ca 、Mn ）联合使用。最早为美国国立卫生研究院（NIH ）所采用的肝素-锰沉淀法（HM 法），后多采用硫酸葡聚糖- Mg （DS- Mg 法）。欧洲则多采用磷钨酸-镁沉淀法（PTA- Mg法）和聚乙二醇沉淀法(PEG法) 。1995年中华医学会检验分会曾在国内推荐PTA- Mg法作为HDL-C 测定的常规方法。但此类方法常因含apoB 的脂蛋白组分，沉淀不完全而导致结果假性偏高。第二类采用简便的磁珠DS- Mg法，省去了离心步骤，但需要特殊装置和试剂而不适于推广应用。第三类为匀相测定法，即直接测定法。其特点为：标本用量少，不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪测定，在准确度和精密度方面基本达到美国国家胆固醇教育计划（NCEP ）的分析目标，因此在短短的数年里迅速为临床实验室采用。
【目的】
掌握磷钨酸镁沉淀法测定HDL-C 的基本原理。
熟悉磷钨酸镁沉淀法测定HDL-C 的手工法操作过程。 了解磷钨酸镁沉淀法测定HDL-C 对判断高脂血症、预防动脉粥样硬化和冠心病的重要生理意义。
【原理】
采用大分子多阴离子化合物（磷钨酸盐）与两价阳离子（镁离子）作学沉淀剂沉淀血清中的LDL 、VLDL 和Lp(a)后，2+2+2+2+2+2+2+2+
上清液中只含有HDL ，然后用酶法测定其中的胆固醇含量，即血清中胆固醇酯可被胆固醇酯酶水解为游离胆固醇和游离脂肪酸（FFA ），胆固醇在胆固醇氧化酶的氧化作用下生成△4-胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢在4-氨基安替比林和酚存在时，经过氧化物酶催化，反应生成苯醌亚胺的红色醌类化合物，其颜色深浅与标本中胆固醇含量成正比。
【试剂】
1. 沉淀剂
磷钨酸 100mmol/L
氯化镁 5mmol/L
2. 酶试剂（试剂R ）
GOOD ＇S 缓冲液（pH6.7） 50mmol/L
苯酚 5mmol/L
4-氨基安替比林 0.3mmol/L
胆固醇酯酶 >200U/L
胆固醇氧化酶 >100U/L
过氧化物酶 >3KU/L
3. 胆固醇标准液（1.18mmol/L/70.00mg/L）
【器材】
1. 试管
2. 加样枪
3. 水浴箱
4. V-1100分光光度计
【操作步骤】
1.HDL-C 分离
取血清和沉淀剂各200ul ，充分混匀，置室温放置10min 后，3000r/min，离心15min ，吸取上清液按下表操作。如果上清液混浊，则需再以转速10000r/min，离心15min 。
2.HDL-C 测定
加入物（ul ） 空白管 标准管 测定管 上清液 — — 40 标准液 — 40 — 蒸馏水 40 — — 酶试剂 2000 2000 2000
各管混匀后，37℃水浴10min ，于波长500nm 处以空白管调零，测定各管吸光度。
【计算】
HDL-C （mmol/L）=测定管吸光度/标准管吸光度×胆固醇标准液浓度
【参考范围】
血清HDL-C ：0.9～2.0mmol/L
【临床意义】
HDL 是一种抗动脉粥样硬化的脂蛋白，是冠心病的保护因素，冠心病的发病率与血清HDL 水平呈负相关，HDL-C 低
于0.9mmol/L是冠心病的危险因素，其增高被认为是冠心病的“负”危险因素。
HDL-C 下降多见于脑血管病、糖尿病、肝炎、肝硬化等。 高TG （总胆固醇）血症常伴有低HDL-C; 肥胖者、吸烟者的HDL-C 也常偏低，但饮酒和长期体力活动会使之升高。
【注意事项】
1. 血清在室温条件下，各类型脂蛋白之间还会发生脂质交换，游离的胆固醇也会不断酯化，所以要及时测定，否则应该冰冻保存，但是只能冰冻一次，解冻后应立即测定。
2. 离心过程中应该防止温度升高使沉淀不完全，室温应为15～25℃之间，且离心后立即吸取上清液进行测定，否则结果偏高。
3. 血清严重混浊时，可以将血清以生理盐水1：1稀释后再沉淀，测定值乘以稀释倍数即为实际值。
【思考题】
1. 临床实验室测定HDL-C 的方法有哪些？
2. 温度和pH 值是如何影响磷钨酸-镁沉淀法测定HDL-C ？
3. 简述检测HDL-C 的临床意义。