人巨细胞病毒感染的实验室检测与诊断
震弼儿射临番客刍第27卷第10彤]2012年5月JApplClin
Pediatr.I/01.27No.10.May2012
・729・
・幸家论坛・
DOI:10.3969/j.issn.1003-515X.2012.10.001
。’
人巨细胞病毒感染的实验室检测与诊断
阮强,何蓉
(中国医科大学附属盛京医院病毒研究室,沈阳110004)
LaboratoryDetectionand
DiagnosisofHumanCytomegalovirusInfection
ChinaMedicalUniversity,Shenyang110004,Liaoning
RUAN()缸,lg,tie舶昭
(ViresLaboratory,Shen舀ingHospitalAffiliated
to
Province,China)
摘要:人巨细胞病毒(HCMV)是儿童先天性感染和出生后获得性感染的莺要病原,可引起多种急、慢性感染和神经系统迟发后
遗症。早期、准确诊断HCMV感染意义重大,但仅依靠临床表现难以对HCMV感染做出明确诊断。现简要介绍HCMV感染的实验室检测及诊断新技术。
实用儿科锰床杂志。2012。27Ilo):729—731
关键词:人巨细胞病毒;感染;实验室检测;诊断
中图分类号:R729
文献标识码:A
文章编号:1003—515X12012)10-0729-03
人巨细胞病毒(HCMV)属于疱疹病毒口亚科,含线状双链DNA分子,长度为220—240kb¨o,在形态、基因结构上与其他疱疹病毒相似。HCMV可长期或间歇地从患者或隐性感染者的唾液、精液、尿液、乳液和子宫颈分泌物中排出病毒。HCMV感染在我国流行广泛,且首次感染多发生于婴幼儿时期。HCMV一旦侵入人体,将长期或终身存在于体内,在绝大多数免疫正常个体,常表现为无症状感染;但在免疫抑制个体、胎儿和小婴儿可出现明显症状。HCMV感染的靶器官与宿主年龄密切相关,中枢神经系统损害和各种先天畸形仅见于先天性宫内感染的胎儿,婴幼儿感染以肝炎、肺炎多见,而较大儿童多无症状。由于HCMV感染缺少典型的临床症状,仅靠临床表现不能明确HCMV感染的诊断。为了能早期、快速而准确地诊断HCMV感染,及时给予治疗,以便降低疾病的危害性和病死率,现简要介绍HCMV感染实验室检测技术及其实验室检测结果对诊断的意义。
1
毒含量高的组织标本,并保汪低温快速运送标本。病毒分离阳性具有病毒感染的确切诊断意义,但由于标本采集、运送、细胞状态与敏感性以及实验操作等原因,假阴性结果常不能完全避免。
由于HCMV增殖很慢,传统的试管培养法进行病毒分离达不到早期快速检测的目的。改良的快速病毒培养
方法足将检测标本离心后接种到生长在飞片(eovere]ip)
上的单层细胞培养16—36h,然后用HCMV即刻早期蛋
白IE72的单克隆抗体进行免疫荧光实验或酶免疫实验,检测细胞中的病毒即刻早期蛋白,阳性细胞胞核内着色。因为tlCMV即刻早期蛋白1E72是在病毒复制早期产生的病毒蛋白,所以IE72是病毒复制的诊断指标。该法与传统方法比较具有检测时问短和敏感性高的优点,故常用作HCMV感染的确认实验。
Alexander等"1建立了一种新的微量病毒检测技术,将快速组织培养与免疫荧光技术结合,把人胚肺成纤维细胞培养于96孔微板中,并向其中加入处理过的单克隆抗体,接种后3d即检出结果。该方法适合大量临床标本的检测。并具有省时的特点。
1.2病毒抗原学检测pp65抗原血症检测法:pr,65是HCMV表达的一种晚期蛋白,是HCMV活动性感染的早期标志性产物【3】。采用pp65单克隆抗体通过免疫荧光技术或流式细胞技术对患者自细胞中pp65抗原进行定性或定量检测。该方法操作简单,可以量化,虽然其检测灵敏度没有现代分子生物学技术高,但其阳性结果与感染患者出现临床症状的对应性良好,已成为国际公认的HCMV有症状感染的标准诊断方法之一,常被用作对照来评价新诊断方法的敏感性和特异性。pp65抗原血症检测法对HCMV感染有早期诊断作用,研究表明pp65阳性者外周血白细胞的数齄与HCMV感染疾病的临床表现直接相关。监测pp65水甲.的高低能帮助临床预测发生tlCMV感染的可能性,故可指导临床预防性用药H1。
HCMV感染实验室检测技术及对诊断的意义
1.1病毒学检测病毒分离足HCMV感染实验室诊断
的金标准,可作为活动性感染的诊断指标之一。传统的试管培养法是将血,尿、唾液、羊水、脑脊液、支气管肺泡灌洗液等待检标本接种到人胚肺成纤维细胞等敏感细胞上进行培养,病毒的生长繁殖可导致感染细胞出现典型的细胞肜态改变,即细胞病变效应。HCMV在人胚肺成纤维细胞上出现典型细胞病变一般需要l一3周,阳性结果需要进行免疫学等方法的鉴定。做出HCMV病毒分离阴性诊断需要至少4周以上,必要时还需要进行肓传。病毒分离足检测具有复制活性的病毒,需要准确采集病
作者简介:阮强.男.研究员。教授.博上生导师.中华医学会医学病毒学分会副主任蚕员.先后主持完成1日家级、省部级研究课题10多项.参与困家“八无”和“九五”攻关项日2项,近5a来.主持完成1日家自然科学基金课题3项,主持承.ffjl日家自然科学基金课胚I项。指导进行囡家自然科学堆金课题5项,发表柞|j∈论文100余篇,研究疗向为人巨细胞病檬感染致痫机制的分子基础,电了信箱ruanq@sj—hospital.org。
万方数据
霞弼确嫱瘩客壶第”卷第10期2012年5月JAppl“n
Pediair。VoL27No.10,May2012
・730・
1.3病毒血清学检测
1.3.1
HCMVlgG和IgM抗体检测HCMV感染后可
引起机体的体液免疫反应,产生特异性抗体。间接反映HCMV感染的存在。可以选用的血清学方法很多,可用于包括免疫荧光实验、酶免疫实验和化学发光技术等。其中酶免疫实验和化学发光技术操作简便,并可以进行自动化操作,是目前最常用的实验室检测方法,而免疫荧光技术则更适合于小批龟检测使用。以上方法已经有商
品化的诊断试剂可供选用。HCMVIgG抗体阳性表明有
既往感染,血清IgG抗体阳性转化表明是原发感染,而连续监测IgG滴度急剧升高表明存在HCMV活动性感染。
HCMV
IgM抗体是抗原刺激机体后最早出现的抗体,半
寿期较短,通常只持续3-4个月,血清内菪出现HCMV特异性IgM抗体,表明有近期感染。因此,IgM抗体检测是判断HCMV近期感染的霍要依据。抗HCMVlgM抗体检测阳性表明机体近期存在活动性感染,如果同时抗IIC-
MV
IgG抗体阴性,则表明足HCMV原发性感染。
1.3.2
IgG抗体亲和力测定判断HCMV感染足否是
原发感染,对评价HCMV先天性感染的危害程度具有重
要意义。同时测定特异性HCMVIgG和IgM,可推测患者
近期有无HCMV的活动感染,但IgM阳性并不能证明为病毒的原发感染。Hedman等”刮建立的IgG抗体亲和力测定方法配合HCMVlgM检测,可有效区分HCMV原发感染和继发感染。有证据表明人接触HCMV抗原后,其产生的特异性IgG抗体亲和力随免疫时间的延长而增加"1。因此,抗体亲和力低说明为近期原发性HCMV感染,抗体亲和力高说明其原发感染发生在较长时间前,或为通过输血或通过胎盘而被动获得的抗体。用抗原包被酶标板,加入患者血清,再用尿素处理,可以去除低亲和力抗体(早期抗体)。根据尿素处理前后IgG抗体检测结果的变化可确定IgG抗体亲和力的强弱,判断出足否为原发感染。该方法简单易行,只需在常规lgG检测的ELISA试验中增加尿素处理变性后洗脱的步骤即可。研究表明以血清IgM检测作为初筛,然后对lgM阳性结果的标本进行IgG抗体亲和力指数的测定,通过联合检测HCMV特异性lgM抗体和IgG抗体的亲和力可提高检测的敏感性及准确性,明确是否发生原发感染的诊断¨J。1.4病毒核酸检测
1.4.1定量PCR技术实时荧光定量PCR足目前应用较多的定量PCR方法。实时荧光定量PCR是通过在普通PCR反应中加入同时含有荧光报告基团和荧光淬灭基团的探针,在PCR反应过程中具有5’到3’外切酶活性的聚合酶将2个荧光基团切割分离而产生荧光信号,荧光信号强度的变化与新DNA链的产生呈正相关,通过对荧光信号的实时监测来实现对PCR产物量的监测,并精确计算出PCR初始模板量。实时荧光定量PCR技术融合了PCR的敏感性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量等优点。此方法重复性好,定量结果准确,无扩增产物
万方数据
污染,而被广泛应用。因为病毒DNA的出现通常早于病毒感染的临床症状或血清学反应,采用实时荧光定量PCR技术进行HCMV感染过程中DNA数量的检测对评价抗HCMV治疗和预防效果具有重要意义。目前,已经
有商品化的HCMVDNA定量检测的试剂盒可供实验室诊断选用。
1.4.2核酸序列依赖的扩增(NASBA)
NASBA的基本
原理是由一对引物介导的、连续均一的、体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。NASBA整个扩增反应仅由3种酶控制,反应不需要特殊仪器,易实现自动化;而且反应不需要高温变性步骤,不会受到外来双链DNA的污染;可避免常规检测和分析RNA的标准方法中需要大量RNA;反应快、敏感性高、重复性良好。病毒特异性
mRNA是病毒复制与否的标志,通过检测HCMV
mRNA
可早期诊断HCMV活动性感染。该技术足在DNA背景下直接扩增mRNA的等温扩增技术。近年来该技术开始
应用于HCMVmRNA检测,是一项值得期待的HCMV活
动性感染实验室诊断技术。
1.4.3基因芯片技术基因芯片或DNA芯片是近年来发展起来的新兴生物技术,足将大量已知DNA序列的探针通过一定方式固定于某种固相载体表面,形成致密、有序的DNA分子点阵。然后以待测标本的基因进行杂交或反应,反应结果用同位素法、化学荧光法、化学发光法或酶标法显示,以精密的扫描仪或特定的摄像技术对芯片进行扫描,通过计算机软件,做出综合信息分析。基因芯片技术以其高通量、快速、客观、准确的特点,在生物医学领域有着广泛的应用,但这一技术目前仅被应用于
HCMV的研究工作中。
2实验室诊断的注意事项
HCMV感染实验室检测的各种方法均具有各自优势,同时也存在各自的不足。目前各项技术的结合应用足检测HCMV感染的趋势。对HCMV感染的诊断则应密切结合临床,通过对多项实验室检测指标进行综合分析而得出临床诊断。HCMV感染的实验室诊断还需要注意以下几个问题。
2.1抗HCMVIgG检测结果
由于年龄<6个月的婴
儿可以从母体获得胎传IgG抗体,加之很难区分和排除胎传抗体造成的假阳性,因此对年龄<6个月的婴儿一般不进行I{;G检测;对严重免疫缺陷者抗体的检测,需要注意可能出现假阴性结果的可能。
2.2抗HCMVIgM检测结果新生儿和幼小婴儿免疫
系统发育尚不完善。对于IgM结果的评价必须注意可能出现假阴性结果;另外,受患儿体内高水平IgG和类风湿因子等干扰,实验结果可出现假阳性。
2.3检出HCMVDNA特异片段,只能表明HCMV感染的存在,不能区分是否为活动性感染或潜伏性感染。
参考文献:
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protein—coding
衷JIj山射临番姑27卷第101#]2012年5月JApplClinPediatr.VoL27No.10.May2012
content
・731・
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at
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(收稿日期:2012-03—10J
(本文编辑:王家勤)
DOI:10.3969/j.issml003-515X.2012.10.002
新乡市小儿肺炎支原体、肺炎衣原体感染情况
韩玉芳1,魏琴2,冯艳广2,齐振普1,王淑娟1,吴园园1
(1.新乡市第一人民医院检验科,河南新乡453000;2.新乡市第一人民医院风湿免疫科,河南新乡453000)
Analysisof
MycoplasmaPneumoniaeandChlamydiaPneumoniae
Infectioniii
ChildreninXinxiangCity
删Ⅳh一知昭1,WEIQin2,FENGYan—g%留。讲Zhen—pul,WANG懿H一丘mnl,WU
Yuan—ymn’
摘要:目的分析新乡市儿童肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CPn)感染情况。方法选取符合肺炎诊断标准的308例患儿,应用胶体金法行血MP—IgG、CPn-IgG、MP—IgM及CPn—lgM抗体检测,并对所有病例的临床资料进行统计学分析。结果308例肺炎患儿中检出MP、CPn阳性病例80例(其中混合感染9例);婴儿组与儿童组、幼儿组与儿童组感染率比较差异均有统计学意义(卫2=13.40,P<0.05∥=8.71,P<0.05)。MP感染70倒,感染率为22.73%,各年龄组问MP感染率比较差异无统计学意义(Xz=1.67,P>0.05);CPn感染19例,阳性率为6.16%,各年龄组问CPn感染率比较差异无统计学意义(r=0.12。P>o.05)。结论MP、CPn是新乡市d,JL肺炎感染的重要病原体,存在混合感染的现象,应重视MP、CPn的寅验室依据,早期合理诊治。
t
实用儿科临床杂志.2012。27t101:731。785
关键词:肺炎;抗体;肺更支原体;肺炎衣原体;胶体金法中图分类号:R725.6
文献标识码:B
文章编号:1003—515X(2012)10—0731—02
肺炎支原体(MP)、肺炎衣原体(CPn)是非典型病原体,对大环内酯类抗生素敏感,而对B内酰胺类抗生素和氨基糖苷类抗生素不敏感。为了解新乡市d,JL检测。现报告如下。1资料与方法
1.1一般资料选取木院2008年3月一2011年7月308例住院肺炎患儿为肺炎组,均符合肺炎诊断标准…。男203例,女105例;年龄20d~14岁[(6.4±5.8)岁];病程7—20(14.3±3.6)d。分为婴儿组(20d—l岁)49例(男33例,女16例)、幼儿组(>1—3岁)82例(男53例,女29例)、儿童组(>3一14岁)177例(男118例,女59例)。选取同期本院体检健康儿童50例为健康对照组。男33例,女17例;年龄25d一14岁[(7.2±6.4)岁]。2组性别、年龄差异均无统计学意义(P.>0.05),具有可比性。受试者家属均签订知情同意书。
1.2方法研究对象均抽取空腹静脉血2.5mL,不抗凝,置水浴箱37℃水浴20
5
rain,4000
IgM及CPn—IgM检测,试剂盒由潍坊市康华技术有限公司提供。
1.3统计学处理应用SPSS17.0软件,计数资料采用
MP、CPn
感染状况,本研究对本院收治的肺炎患儿进行MP、CPn
r检验,P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1肺炎患儿MP、CPn检测结果308例检出MP、CPn阳性病例80例(其中MP、Cpn混合感染9例)。MP感染占87.50%(70/80例),CPn感染占23.75%(19/80例)。婴儿组与儿童组、幼儿组与儿童组MP及CPn感染率比
较差异均有统计学意义(疋2=13.40,P<0.05;f=8.7l,
P<0.05),见表1。健康对照组50例未检出病原体。
表1
婴儿组、幼儿组及儿童组肺炎患儿血清MP、CPn检测结果
[n(%)】
2.2
MP、CPn阳性构成及病原年龄分布80例MP、
r・rain“离心
rain,分离血清,采用胶体金法行MP-IgG、CPn-IgG、MP・
CPn阳性肺炎患儿中婴儿组4例(混合感染I例)、幼儿组14例(混合感染1例)、儿童组62例(混合感染7例);MP阳性构成比分别为婴儿组100%(4/4例)、幼儿组78.57%(11/14例)、儿童组88.7l%
(下转第785页)
作者简介:韩玉芳,女,副主任技师,大学学历,研究方向为免疫检验,电子信箱mmeeyyl23@sohu.eom。
万方数据
人巨细胞病毒感染的实验室检测与诊断
作者:作者单位:刊名:英文刊名:年,卷(期):被引用次数:
阮强, 何蓉, RUAN Qiang, HE Rong
中国医科大学附属盛京医院病毒研究室,沈阳,110004实用儿科临床杂志
Journal of Applied Clinical Pediatrics2012,27(10)10次
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引用本文格式:阮强. 何蓉. RUAN Qiang. HE Rong 人巨细胞病毒感染的实验室检测与诊断[期刊论文]-实用儿科临床
杂志 2012(10)