7种小蠹虫酯酶同工酶的比较研究
・7
0・续研究。
第33卷第6期(2007)
PLAN T PRO TECTION 研究报告Vol. 33No. 6(2007)
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7种小蠹虫酯酶同工酶的比较研究
梁 靓1, 段立清13, 2, 2
(1. 内蒙古农业大学农学院, 呼和浩特 ; 011100)
摘要 , , 给木材的检疫工作带来较大困难。当遇到, 。应用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对俄罗斯进境木材7种小蠹虫幼虫、。结果表明7种小蠹虫幼虫酶带数目均比成虫多, 酶活性也较成虫强。幼虫和成虫之间有多条迁移率接近的酶带, 酶带相似性及聚类分析均证明可以将这些酶带作为种的特征性谱带。研究表明, 当形态特征作为鉴定标准较难准确掌握时, 可用幼虫或成虫同工酶电泳图谱来鉴定其种类。关键词 小蠹虫; 酯酶同工酶; 聚丙烯酰胺凝胶电泳中图分类号 S 41-34
A Comparative Study on the Esterase Isoenzymes of 7B ark Beetles
Liang Liang 1, Duan Liqing 1, Y in Fengmin 2, Yang Y ongsheng 2
(1. A g ricultural College of I nner Mongolian A g ricultural Universit y , H uhhot 010019, China; 2. I nner Mongolian A utonomous Region I m port and Ex port I ns pection and Quarantine B ureau , H uhhot 011100, China )
Abstract Bark beetles are morphologically difficult to distinguish due to their small size. Moreover , the larval sam 2ples of bark beetle were collected f rom the logs and this made the quarantine work even more difficult , since the lar 2vae have to be reared to the adult stage for identification. Esterase isoenzymes f rom both larval and adult stages of 7bark beetles collected f rom logs in Russia were compared by polyacrylamide gel electrophoresis. The results showed that the esterase isoenzyme bands of larval stage were more than that of adult stage for all 7bark beetles. The en 2zymes of larval stage were more active than that of adult stage. There were some common enzyme bands with similar relative mobility for larval and adult stages among the homogeneity and some different bands among the heterogenei 2ty. The possibility of using the enzymes characteristics to distinguish the species and to analyze their relationships was testified by the similarity of enzyme bands and clustering analysis. The studies showed that bark beetles could be distinguished by isoenzyme electrophoresis zymogram , no matter whether the samples were collected at larval stage or adult stage.
K ey w ords bark beetle ; esterase isoenzyme ; polyacrylamide gel electrophoresis
自20世纪50年代以来, 随着分子生物学、生物化学和群体遗传学研究方法在分类学领域的渗透, 同
收稿日期: 2007204213
基金项目: 内蒙古出入境检验检疫局研究项目3通讯作者E 2mail :[email protected]. cn
工酶技术被广泛应用到昆虫分类、遗传、进化[1]、幼虫鉴别[2]、昆虫行为[3]、抗性和防治[4]等诸多方面, 成为
研究报告
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研究昆虫的遗传变异、物种进化及种属鉴定的重要生化指标。同工酶是具有相同或相似催化功能而分子结构不同的一类酶, 是最复杂、最具多态性的酶系[5]。其特点是用同一染色方法显示出的相同酶带在遗传和生化上具有同源性, 因而可从不同物种间同工酶谱的差异程度来推测它们的分类地位和亲缘关系[6]。
小蠹虫隶属鞘翅目(Coleoptera ) , 小蠹科(Sco 2lytidae ) , 是一类重要的森林害虫。口岸检疫时从木
出现错误。本文用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对俄罗斯进境木材携带的7种小蠹虫的幼虫、成虫的酯酶同工酶进行了比较分析, 旨在探讨通过酯酶同工酶电泳方法来鉴别出小蠹虫幼虫和成虫的可行性, 建立酶谱图库, 帮助口岸检疫工作提高通关效率。
1 材料与方法
1. 1 材料
材中经常截获到一些小蠹虫幼虫, 通常需饲养至成虫才能确定其种类, 需时较长。而且, 小蠹虫的幼虫饲养比较困难。即使获得的是成虫, 由于虫体微小, 鉴定所用的形态特征难以准确掌握, 鉴定结果极易
种
桦边材小蠹(Scol yt us ratzeburgi J )
纵坑切梢小蠹() 枞十二齿小蠹(I ps B 六齿小蠹(I. ) 重齿小蠹(I. du plicat us Sahalberg ) 中重齿小蠹(I. manns f el di Wachtl )
落叶松八齿小蠹(I. subelongat us Mot schulsky )
(() 齿小蠹亚科(Ipinae ) 齿小蠹亚科(Ipinae ) 齿小蠹亚科(Ipinae ) 齿小蠹亚科(Ipinae ) 齿小蠹亚科(Ipinae )
供试7种小蠹虫种类、寄主及寄主产地见表1。7种小蠹虫均于2006年7月采自内蒙古二连浩特
口岸进口木材。活虫体经低温冷冻致死后保存于-45℃。
(Bet ula plat y phy lla )
樟子松(Pinus sylvestris mongolica ) 樟子松(P. sylvestris var. mongolica ) 鱼鳞松(Picea micros perma ) 鱼鳞松(P. micros perma ) 鱼鳞松(P. micros perma ) 落叶松(L ari x gmelinii )
寄主植物产地克拉斯诺尔斯克布里亚特共和国
乌兰乌德克拉斯诺尔斯克克拉斯诺尔斯克克拉斯诺尔斯克
伊尔库范克
表1 小蠹虫种类1. 2 方法
取冷冻虫体, 成虫切去鞘翅和腹部, 用蒸馏水
洗净吸干后称重, 按质量体积比(1∶8) 加入缓冲液冰浴匀浆。缓冲液组成:50mmol/L Tris 2HCl , 0. 25%TritonX 2100,p H7. 0。冰浴匀浆20min 后
2 结果与分析
2. 1 7种小蠹虫幼虫、成虫酯酶同工酶酶谱分析
7种小蠹虫幼虫和成虫的酯酶同工酶酶谱谱
带颜色分为较深、较浅、极淡。酶带颜色深代表酶活性强, 带宽代表酶含量高[8]。各条酶带R f 值见表2。
7种小蠹虫幼虫、成虫各条酶带边界清晰, 基本
于4℃,12500r/min 离心15min , 取上清液加入等体积40%蔗糖溶液作为测试酶源放入冰箱中保存备用。
采用D YY 212型电脑三恒多用电泳仪和D YY 2Ⅲ28B 型夹芯式垂直电泳槽。分离胶浓度为8%, p H8. 9; 浓缩胶浓度为2. 5%,p H6. 7; 电极缓冲液
无拖带现象, 除个别活性偏低的酶带外, 大部分特征带均可用肉眼辨析。由表2可看出, 各种小蠹虫的幼虫与成虫的共有酶带数均接近其酶带总数的一半, 并且都有共同的主带, 这说明幼虫和成虫酯酶具有很大的共性。幼虫的酶带数明显多于成虫, 说明幼虫酶活性高于成虫酶的活性。R f 值为0. 61
～0. 62及0. 67～0. 69两个区域的酶带应为齿小蠹属(I ps ) 的特征酶带。该属中5个种的幼虫、成虫均有
为Tris 2G ly ,p H8. 3。凝胶厚度为1. 5mm , 点样量为10μL 。初始电流为15mA , 当前沿指示剂涌出浓缩胶面时, 电流升至23mA 。电泳至前沿指示剂溴酚蓝距凝胶末端约1cm 时止, 全过程需5～6h 。每个处理重复3次。电泳结束后取下凝胶进行染色[7]。1. 3 数据处理
该区域的酶带, 且酶带颜色深、清晰, 而种间幼虫及成虫酶带差异较大。重齿小蠹与中重齿小蠹成虫酶带极其相近, 只是重齿小蠹成虫酶带中在R f 值为0. 62～0. 68间多1条较为明显的R f 值为0. 65的酶
染色后的凝胶立即拍照, 测量相对迁移率(R f
值) , 相对迁移率根据下式进行计算:
R f =x 1/x 2
带。中重齿小蠹成虫多1条R f 值为0. 34的酶带, 这两条带可能为种的特征酶带。小蠹属(S col y t us ) 和梢小蠹属(Tomicus ) 因同属的种类太少, 分别只有
x 1为固定染色后凝胶中酶蛋白区带的迁移距离;
x 2为固定染色前凝胶中指示剂的迁移距离。
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1种, 属内共有酶带尚不能确定。但可以看出, 桦边
材小蠹的酶带R f 值为0. 43～0. 59之间为主要特征酶带。而纵坑切梢小蠹的酶带除了一个R f 值较小
酶带号
[***********][**************]22
A --0. 24-0. 27-0. 33-0. 39-0. 430. 450. 470. 49-0. 570. 59-----B ----------0. 430. 450. 470. 0. ------C --0. 24------------0. 60-0. 620. 65--D ----0. 28--------0. 570. 60--0. 65--E -----0. 29-0. 350. 40---0. 52--0. 61---0. 69
F --------0. 40-----0. 520. 56-0. 61---0. 71
G
且不太清晰的酶带(幼虫R f 值为0. 24, 成虫R f 值为
0. 28) 外, 其余酶带集中在R f 值为0. 50～0. 65之间, 相对其他种酶带较少。
H --0. 230. 260. 27----------0. 61--0. 67-I 0. 18----0. 300. 340. 360. 390. 4142-----0. 59-0. 62-0. 66-J -------0. 360. 3941------0. 620. 65-0. 68
K -0. 200. 230. 26---0. 360. 39-----0. 56--0. 62-0. 66-L ------0. 340. 360. 390. 41--------0. 62--0. 68
M 0. 190. 210. 230. 26-0. 29-----0. 44-0. 500. 52--0. 610. 620. 64-0. 68
N --0. 230. 26-0. 29-----------0. 610. 620. 64-0. 69
表2 7种小蠹虫幼虫、成虫酯酶同工酶酶带R f 值1)
0. 180. 200. 230. 26-0. 29------48--0. 590. 61--0. 670. 69
1) A 、B :桦边材小蠹幼、成虫;C 、D :纵坑切梢小蠹幼、成虫; E 、F :枞十二齿小蠹幼、成虫; G 、H :六齿小蠹幼、成虫; I 、J :重齿小蠹幼、成虫; K 、
L :中重齿小蠹幼、成虫; M 、N :落叶松八齿小蠹幼、成虫。“-”表示无。
2. 2 7种小蠹虫幼虫、成虫酯酶同工酶酶带数比较2. 3 7种小蠹虫的酯酶同工酶相似性比较
根据表2测得的7种小蠹虫幼虫、成虫酯酶同工酶R f 值数据, 对小蠹虫幼虫和成虫的酯酶同工酶酶带数量进行比较(表3) 。由表3可见不同种小蠹虫幼虫、成虫共有酶带的R f 值都各不相同, 彼此易于区分。
表3 7种小蠹虫幼虫、成虫酯酶同工酶带数比较
种桦边材小蠹
虫态
酶带数
10
5547511 510 68612 7
根据幼虫、成虫酯酶同工酶酶带R f 值的相似程度(表4) 来确定对比种的相似程度。
C =[2W /(a +b ) ]×100%,
式中a :种A 酶带数; b:种B 酶带数; W :A、B 两种相同的酶带数; C :相似性系数。
表4 7种小蠹虫幼虫和成虫酯酶同工酶相似性比较
种
桦边材纵坑切枞十二六齿小
小蠹幼梢小蠹齿小蠹幼蠹幼虫虫/成虫幼虫/成虫虫/成虫/成虫
重齿小中重齿蠹幼虫小蠹幼虫/成虫/成虫
相同酶
带数
5244437
相同酶带R f 值1)
0. 43,0. 453,0. 473,
0. 493,0. 573
0. 6030. 650. 40,0. 52, 0. 613,0. 690. 23,0. 26, 0. 613,0. 670. 36,0. 39, 0. 41,0. 623
0. 363,0. 393,
0. 623
0. 23,0. 26,0. 29,0. 61,
3
3
3
幼虫成虫
纵坑切幼虫梢小蠹成虫
幼虫
枞十二齿小蠹
成虫幼虫
六齿小蠹
成虫幼虫
重齿小蠹
成虫幼虫
中重齿小蠹
成虫
落叶松八幼虫齿小蠹成虫 1) 3表示主带。
纵坑切梢
13/22
小蠹
枞十二齿小蠹0/0六齿小蠹重齿小蠹中重齿小蠹落叶松八齿小蠹
10/00/00/00/0
0/00/00/200/00/0
44/200/180/1842/33
10/032/043/50
44/8318/31
30/31
从表4可见, 齿小蠹属中的重齿小蠹和中重齿小蠹幼虫、成虫酯酶同工酶酶带R f 值相似程度强, 相似性系数C 分别为44%和83%。这两个种成虫的外部形态特征也非常相近。落叶松八齿小蠹与枞
研究
报告
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十二齿小蠹、六齿小蠹、重齿小蠹及中重齿小蠹均有较大的相似性。齿小蠹属中的5个种类除六齿小蠹与桦边材小蠹C 为10%外, 与桦边材小蠹、纵坑切梢小蠹幼虫酯酶同工酶酶带R f 值相似性系数均为零, 形态上也表现出非常明显的区别, 与形态分类结果一致。虽然幼虫种间的相似性与成虫种间的相似性结果存在一些差异, 但总体上还是说明了属内差异小于属间差异。7种小蠹虫幼虫、成虫的相似性的差异可能与幼虫、成虫的酶带数目、迁移率有关。2. 4 聚类分析结果
蠹属聚类距离也较远。此聚类结果与形态分类研究的亲缘关系基本一致, 反映出种、属的亲疏关系。同属的种类常具有相似或相同的酶带, 不同种又各具其特征酶带, 所以可用于种的鉴定分类, 特别是近缘种或相似种的鉴定。从总体上来说, 成虫聚类时的距离系数要小于幼虫聚类时的距离系数, 说明成虫更能反映出小蠹虫系统的进化关系。
3 讨论
通过对7种小蠹虫酯酶同工酶电泳酶谱的分析, 幼虫酶带数明显多于成虫, 说明幼虫酶活性也要高于成虫[9], 且酶、成虫酯酶同工酶酶谱, 有多条相同或相近迁移率的酶带, 不同种间酶带有明显差异性。齿小蠹属中的5个种具有相近的较大迁移率的酶带, 与其他2个种有明显的区别。故可用小蠹虫幼虫或成虫酶谱作为较好的生化指标, 积累较多种类幼虫、成虫酶谱, 可查阅酶谱谱带特征进行分类鉴定。
酯酶同工酶受昆虫的性别[10]、发育期[9]等影响。本文由于时间的关系对进境木材小蠹虫标本采集缺少连续性, 未能就小蠹虫幼虫不同龄期进行分别比较研究。同样, 由于虫体小, 雌、雄个体从外部形态上鉴别较难, 性别之间的差异也尚未进行比较, 以上问题有待于进一步开展深入研究。另外, 同种生物个体由于所处地理位置不同, 其酶活性等受到影响。周楠等研究分布于云南省的松纵坑切梢小蠹酯酶同工酶[9], 证明不同虫态迁移率均值在0. 543～0. 677之间的两条酶带为该种的特征酶带。进境木材中截获的同种小蠹虫同样在该区酶带最为清晰, 成虫酶带中可见R f 值为0. 57、0. 60和0. 65的3条酶带, 幼虫可见4条酶带。
7种小蠹虫幼虫、成虫酯酶同工酶的相似性及
用欧氏距离系数, 将距离越近的点归为一类, 距离较远的点归为不同的类, 利用统计软件SPSS 12. 0, 对7种小蠹虫幼虫、成虫进行聚类分析, 所得
结果见图1、图2
。
图1
7种小蠹虫幼虫聚类图
图2 7种小蠹虫成虫聚类图
图1与图2的7种小蠹虫幼虫和成虫聚类分析结果基本一致。幼虫聚类图中, 重齿小蠹与中重齿小蠹在距离系数为1. 416水平上首先聚为一类, 枞十二齿小蠹与六齿小蠹随后聚为一类, 而后齿小蠹属逐步聚为一类。成虫聚类图中, 重齿小蠹与中重齿小蠹在距离系数为0. 538水平上首先聚为一类, 后逐与落叶松八齿小蠹、枞十二齿小蠹及六齿小蠹聚在一起。由图可见, 齿小蠹属中的各种之间距离较近, 其聚类情况反映了它们之间的亲缘关系接近。不论幼虫聚类图还是成虫聚类图, 桦边材小蠹、纵坑切梢小蠹都是在距离较远处归为一类, 并且与齿小
聚类分析, 从亲缘和进化关系上进一步探讨以酯酶同工酶酶带特征分别在幼虫期和成虫期鉴别进境木材小蠹虫的可能性。二者比较的结果是一致的。说明以幼虫或成虫的酯酶同工酶酶带作为种的鉴别特征在一定程度上是可行的。特别适合口岸检疫工作要求快速、准确对有害生物作出判断的要求。但该方面的工作还需要继续进行大量的标本采集和酶带酶谱积累与建库工作, 希望该方面的工作得到重视。
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苜蓿斑蚜刺吸影响
3
(甘肃农业大学草业学院昆虫学系, 兰州 730070)
摘要 研究了苜蓿斑蚜为害苜蓿幼苗初期0～9d 内,15、30头/株两个虫口密度下苜蓿幼苗植株叶绿素含量、SOD 、
POD 、PPO 等酶活性的动态变化。结果表明, 在短期内苜蓿斑蚜刺吸为害使叶绿素含量明显降低, 与同期对照相比
差异达极显著水平(p
Physiological effects of piecing and sucking by Therioa p his t ri f olii on alfalfa seedlings
Lan Jinna , Liu Changzhong
(De partment of Entomology , College of Grassland Science , Gansu A g ricultural Universit y , L anz hou 730070, China )
Abstract The dynamics of chlorophyll contents and the activity of SOD , POD and PPO in alfalfa seedling leaves damaged by T herioap his t ri f olii at different pest densities and in different days were studied. In 0-9days , the chlorophyll content of alfalfa seedling leaves decreased remarkably by piecing and sucking of T. t ri f olii (p
K ey w ords T herioap his t ri f olii ; alfalfa seedling ; chlorophyll ; protective enzyme
害虫与植物的相互作用所构成的种间关系, 无论在生态学理论上, 还是在生产实际中, 都有非常重
收稿日期: 2007204212 修订日期: 2007207222
基金项目: 草业生态系统教育部省部共建重点实验室项目(CY 2GG 22006206) ; 教育部科学技术研究重点项目(206149) ; 甘肃省自然科学
基金(ZS0112A2520302N ) ; 甘肃省教育厅科学基金(032204) 资助。
3通讯作者E 2mail :liuchzh @gsau.edu. cn ;[email protected]