原位杂交-经典方法-地高辛标记探针
原 位 杂 交
(In situ hybridization)
一、 目的
掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。
二、 原理
原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。其基本原理是含互补序列的标记DNA 或RNA 片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA 或RNA 形成稳定的杂交体。
原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA 或RNA 研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。
三、 仪器设备
烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR 仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。
四、 材料和试剂
1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV 病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。
2．试剂：
Davidson’s AFA固定液:
330 ml 95％乙醇
220 ml 福尔马林（37～39％甲醛水溶液）
115 ml 冰醋酸
335 ml H 2O
混匀后封口，室温放置；
DIG 标记与检测试剂盒（Roche 公司）；
TNE ： 50 mmol/L Tris-HCl 6.57 g Tris Base
10 mmol/L NaCl 0.58 g NaCl
1 mmol/L EDTA 0.37 g EDTA
ddH 2O 900 ml （定容至1L ）
用HCl 调pH 至7.4，高压灭菌，4℃保存；
0.4% 甲醛： 37～39％% 甲醛 5.4 ml
ddH 2O 495 ml；
蛋白酶K 溶液 (Pr.K，10 mg/ml)： 10 mg Pr.K 溶于1 ml TNE中（用时现配）； 20×SSC ：3 mol/L NaCl 175.32 g NaCl
0.3 mol/L柠檬酸钠 88.23 g 柠檬酸钠
ddH 2O 900 ml （定容至1L ）
调pH 至7.0，高压灭菌，4℃保存；
2×SSC ： 20×SSC 100 ml
ddH 2O 900 ml
0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；
20×Denhardt ’s 溶液：
0.4％ 牛清血蛋白 0.4 g牛清血蛋白
0.4％ 聚蔗糖 0.4 g聚蔗糖
0.4％ 聚乙烯吡咯烷酮 0.4 g聚乙烯吡咯烷酮
ddH 2O 100 ml
0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；
25％硫酸葡聚糖：25 g硫酸葡聚糖溶于80 ml ddH2O （定容至100 ml），-20℃保存； 杂交液： 4×SSC
50% 甲酰胺
1×Denhardt’s
5% 硫酸葡聚糖
0.5 mg/ml鲑精DNA
4℃保存；
BufferI ： 100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base
150 mmol/L NaCl 8.77 g NaCl
用HCl 调pH 至7.5，定容至1L ，高压灭菌，4℃保存，；
BufferII ： 0.5% Blocking agent 0.5 g Blocking agent
BufferI 100 ml
低温加热溶解，4℃保存一星期；
BufferIII ： 100 mmol/L Tris-HCl 12.11 g Tris Base
100 mmol/L NaCl 5.84 g NaCl
50 mmol/L MgCl2 10.16 g MgCl2•6H 2O
ddH 2O 990 ml（定容至1L ）
用HCl 调pH 至9.5，0.45 µm 滤膜过滤，4℃保存；
BufferIV ：10 mmol/L Tris-HCl, pH8.0, 1 mmol/LEDTA；
显色液（NBT/BCIP使用液）：20 µl NBT/BCIP + 1ml BufferIII。
水性封片剂：甘油明胶
明胶 (gelatine) 8 g
酚 (phenol) 0.5 ml
甘油 (glycerin) 50 ml
dH 2O 48 ml
（酚可选用）
五、 实验方法和步骤
1、 固定
现场取感染病毒、濒死的斑节对虾，于第2、3腹节间和头胸部注射Davidson’s AFA固定液全身固定，切取头胸部，从额剑将头胸部分成2部分，再置Davidson’s AFA固定液中固定12-24h ，转入70%乙醇中保存；或者取感染病源体的鱼类、两栖类、爬行类等的各器官，按同样方法固定。取材厚度一般5 mm 。固定液的量一般不少于所固定组织体积的10倍。
2、脱水和包埋（按常规组织切片技术操作）
脱水：用不同的乙醇浓度脱水
70%乙醇 2次 1h/次 可停留
80%乙醇 2次 1h/次 可停留
95%乙醇 2次 1h/次
无水乙醇 2次 45min /次
透明：
1/2无水乙醇 + 1/2二甲苯 1次 20 min
二甲苯 2次 5 min /次
1/2二甲苯 + 1/2石蜡 1次 30 min
透腊：3次
石蜡I 45min ～1h
石蜡II 45min ～1h
石蜡III 45min ～1h
3、 切片
① 载玻片和盖玻片的准备：3% HCl + 95%乙醇浸泡30min 以上，擦干备用。 硅化载玻片：将载玻片分别浸入下列溶液处理
2% APES(APES溶于丙酮中) 2min
丙酮 1min
dH 2O 1min
烘干备用
② 切4-6 µm 厚的切片于载玻片上，42℃展片过夜。
4、 杂交
① 烘片：将切片放入烘箱内，60℃，烘45min 。
② 脱蜡：
二甲苯 2次 10min /次
1/2无水乙醇 + 1/2二甲苯 1次 5min
③ 水化：
无水乙醇 2次 2～3min /次
95%乙醇 2次 2～3min /次
80%乙醇 2次 2～3min /次
70%乙醇 2次 2～3min /次 可停留 dH 2O 1次 2～3min /次
③ 消化：1×TNE 5min
Pr.K ( 10µg/ml) 200μl/片 37℃ 10 min （湿盒内）
(10 mg/ml母液用TNE 稀释1000倍)
④ 后固定：0.4% 甲醛 5min
⑤ 杂交：2×SSC 5min
探针先于100℃变性5～10 min，立即置冰上5min;
含10～25ng/100µl 探针的杂交液100µl/片，覆盖盖玻片，用矿物油封片。 整个玻片于95℃变性6 min，立即置冰上5min ，42℃杂交过夜（湿盒内）。
5、 冲洗与显色
2×SSC 2次 5 min /次 37℃
1×SSC 2次 5 min /次 37℃
BufferI 5min 室温
BufferII 5min 室温 200µl/片（湿盒内） Ap 使用液 30～45min 37℃ 100µl/片（湿盒内）
(用BufferII 稀释Ap 原液2000倍)
BufferI 2次 5 min /次 室温
BufferIII 5min 室温
NBT/BCIP使用液 2h ～过夜 室温 200µl/片（湿盒内）
避光勿动！
BufferIV 15min 室温 停止显色
dH 2O 2～3min
六、 注意事项
1、 杂交条件：杂交的特异性依赖于探针的结构、杂交温度（高温严谨）、pH 及杂交液中甲酰胺（高浓度）和盐离子的浓度（低盐）。
2、 Pr.K 消化时间一定要严格控制，时间太长，会掉片；时间太短，则消化不够，影响探针进入，可能造成假阴性结果。
3、 杂交时将盖玻片轻轻放在载玻片上，放好后，不可移动，以免破坏盖玻片下面的样品，影响观察。
七、 思考题
1、如何利用原位杂交技术检测组织细胞中的特定RNA （RNA 病毒或者组织细胞内的RNA ）？
2、 杂交液中甲酰胺的作用是什么？