酶学实验2008
酶工程综合实验
超氧化物歧化酶的分离、纯化
超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase ,简称 SOD) 广泛存在于生物体内的含Cu 、Zn 、Mn 、Fe 的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂,可以清除体内多余的超氧阴离子,在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。离子(02-) 是人体氧代谢产物,它在体内过量积累会引起炎症、肿瘤、色斑沉淀、衰
(O2∙)
-酶蛋
第二种含有锰离子(Mn-SOD),主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中,在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在,纯品呈粉红色,由4条或2条肽链组成。第三种是Fe-S0D ,过去一直认为只存在于原核细胞中,近来发现有一些真核藻类甚至某些高等植物中也有存在。Fe-SOD 纯品呈黄色或黄褐色,由2条肽链组成,多数情况下每一个二聚体中含有一个Fe 原子。
第一种类型含有铜和锌,分子量约32000,第二种类型含锰,分子量约40000,第三种类型含铁,分子量约38000。
实验(一) 超氧化物歧化酶的活性测定
【原理】
SOD 的活力测定方法很多,常见的有化学法、免疫法和等电点聚焦法。其中化学法应用最普遍,化学法的原理主要是利用有些化合物在自氧化过程中会产生有色中间物和O2∙-,利用SOD 分解而间接推算
酶活力。在化学方法中,最常用的有黄嘌呤氧化酶法,邻苯三酚法,化学发光法,肾上腺素法,NBT-还原法,光化学扩增法,Cyte 还原法等。其中改良的邻苯三酚自氧化法简单易行较为实用。化学发光法和光化学扩增法不适用于测定Mn-SOD ,但对于Cu/Zn-SOD反应极灵敏。Cyte 还原法用于Mn-SOD 活力测定结果稳定,重复性好。但专一性和灵敏度不够理想,而且需要特殊仪器,实际应用受到限制。亚硝酸盐形成法与CN —抑制剂或SDS 处理相结合,应用于Mn-SOD 测定,灵敏度比Cyte 还原法提高数倍,而且专一性强,重复性好,操作方便,不需要特殊仪器和设备,易于实际应用和推广,是目前较好的测定方法之一。
在一般情况下,SOD 酶活性测定只能应用间接活性测定法。本实验采用邻苯三酚自氧化方法。 邻苯三酚在碱性条件下,能迅速自氧化,释放出O 2∙-,生成带色的中间产物,反应开始后反应液先变成黄棕色,几分钟后转绿,几小时后又转变成黄色,这是因为生成的中间物不断氧化的结果。这里测定的是邻苯三酚自氧化过程中的初始阶段,中间物的积累在滞留30~45s 后,与时间成线性关系,一般线性时间维持在4min 的范围内,中间物在420nm 波长出有强烈光吸收。当有SOD 存在时,由于它能催化O 2∙-与H+结合生成O 2和H 2O 2,从而阻止了中间产物的积累,因此,通过计算即可求出SOD 的酶活性。
酶活力单位定义:在25℃恒温条件下,每毫升反应液中,每分钟抑制邻苯酚自氧化率达50%的酶量定义为1个酶活力单位。
【试剂和器材】
1、试剂
(1)pH8.2、50mmol/L Tris-HCl
称取Tris 0.61g,EDTA-2Na 0.037g,用双蒸水溶解至80mL 左右,用HCl 调节pH =8.20(用pH 计校正),最后定容至100mL 。
(2)10mmol/L HCl
(3)50 mmol/L邻苯三酚
称取邻苯三酚0.063g ,用10mmol/L HCl溶液溶解,定容至10mL ,避光保存。
(4)SOD 样液
2、器材
(1)恒温水浴槽
(2)紫外分光光度计
(3)试管、刻度吸管、微量注射器
【方法和步骤】
1、邻苯三酚自氧化速率的测定
取两支试管按下表加入25℃预热过的缓冲液, 然后加入预热过的邻苯三酚(空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚 ),迅速摇匀,立即倾入1cm 比色杯中,在325nm 波长处测定光吸收值,每隔30s 读数一次,测定4min 内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07(可增减邻苯三酚的加入量,以控制光吸收值)。
2、SOD 样液的活性测定 样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液,再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。
【结果处理】
酶活性(U /m L )=0.070-样液速率50%⨯100%⨯反应液总体积⨯样液稀释倍数
样液体积
实验(二) 大蒜细胞SOD 的提取和分离
【原理】
大蒜蒜瓣和悬浮培养的大蒜细胞中含有较丰富的SOD ,通过组织或细胞破碎后,可用pH7.8磷酸缓冲液提取出。由于SOD 不溶于丙酮,可用丙酮将其沉淀析出。
【材料和试剂】
1、新鲜蒜瓣 2、0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)
3、氯仿-乙醇混合液:氯仿:无水乙醇=3:5
4、丙酮:用前需预冷至4-10℃
【方法步骤】
1、组织细胞破碎:将新鲜的大蒜用大量清水洗净,再用蒸馏水洗净,滤纸吸干后称取约40 g大蒜蒜瓣,置于研钵中研磨。用四层纱布过滤取上清液(记录体积,测酶活性和蛋白浓度)。
2、有机溶剂除杂蛋白:上清液加1~1.1倍体积去离子水,再分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿,剧烈搅拌15min 左右,静置30min (4℃),然后4 000r/min离心20min (5000rpm 离心15min )除去变性蛋白沉淀,收集滤液,过滤(记录体积,测酶活性和蛋白浓度)。
3、加热变形除杂蛋白:将上清液置于60℃ 水浴锅中15 min ,使杂蛋白热变性,然后以10000rpm 冷冻离心10 min,收集上清液(记录体积,测酶活性和蛋白浓度)。
4、SOD 的沉淀分离:清液在冰浴中冷却,然后在-5℃以下的操作温度下,加入1.5倍量预冷丙酮,边加边搅拌均匀,即有白色沉淀产生,静置2~3min ,迅速抽滤,弃去滤液得白色沉淀。沉淀物用少量蒸馏水
溶解,4 000r/min离心20min ,除去不溶物。上清液装入透析袋用pH7.6的2.5mmol/L K2HPO4-KH2PO4缓冲液透析,即得粗SOD 溶液(记录体积,测酶活性和蛋白浓度)。
【结果计算】
1、计算每步操作所得酶液的酶活性、蛋白浓度和比活力
2、计算每步操作的酶活性回收率、蛋白回收率和纯化倍数。
实验(三)离子交换层析纯化超氧化物歧化酶
【原理】
本实验利用超氧化物歧化酶的解离性质,在一定缓冲液条件下与离子交换纤维素吸附和解吸的能力不同于溶液中杂蛋白,进而除去杂蛋白。实验中选用DE-32离子交换纤维素。
相关原理请参见实验教材中离子交换层析一章。
【试剂和器材】
1、试剂
(1)DE-32
(2)缓冲液Ⅰ:2.5mmol/L K2HPO 4-KH 2PO 4(pH7.6)
(1)缓冲液Ⅱ:200mmol/L K2HPO 4-KH 2PO 4(pH7.6)
2、器材
(1)层析柱(2.5cm × 25cm)
(2)部分收集器
(2)梯度洗脱仪
(3)紫外分光光度计
(4)试管、透析袋
【方法和步骤】
1、DEAE-纤维素的预处理:
(1)称取5gDE-32,撒在盛有75mL 0.5mol/L HCl的烧杯中,室温放置30min ,不时轻轻搅拌。
(2)将糊状物移入3号砂芯漏斗中,用蒸馏水淋洗。如此重复,每加一次去离子水,浸泡一段时间,再进行抽滤,至洗涤液pH 等于4即可(pH 试纸试)。
(3)将糊状物移入烧杯中,加入75mL 0.5mol/L NaOH,放置30min ,不时轻轻搅拌,弃去上清液,依同法用0.5mol/L NaOH再处理一次。
(4)将交换剂移入3号砂芯漏斗中,反复用去离子水淋洗,直至洗涤液pH 为8.0(可用pH 试纸测试)。
(5)将DEAE-纤维素浸泡在150mL 去离子水中。用0.5mol/L 盐酸把pH 调至7.6,滴定可在pH 计上进行,须使悬液最终pH 在10min 内无变化,然后抽滤。
(6)将上述滤块置于100毫升量筒中,加入75mL 缓冲液I ,慢慢搅混之后,静置20min ,用倾斜法除去上清液中细微粒子,如此重复若干次,最后上清液pH 与缓冲液I 几乎一致。
2、装柱
(1)层析柱用洗涤液洗清洁,柱的下端联接塑料管,装上螺旋夹。关上螺旋夹,柱内装入缓冲液I ,微开螺旋夹。让缓冲液缓慢流出,赶走死区及塑料管中的气泡,柱中保留少量缓冲液,关闭螺旋夹。
(2)将基本平衡好的DEAE-纤维素浆液(约有1倍体积的缓冲液I )放在抽滤瓶中减压除尽气泡,
然后沿管壁倒人柱中,待沉降至床高约1cm 高度时,部分旋松螺旋夹,让溶液缓慢流出去,注意此时的流速要比正常洗脱时的流速慢,陆续加入较多的浆液,直至达到高10cm 以上的柱床体积。
3、平衡
当全部交换剂装入柱中后,用上柱起始缓冲液进行平衡。流速可维持在
4mL/15min,直至流出液的pH 与上柱缓冲液完全相同。(一般要平衡8h 以上或过
夜。)
4、层析
用毛细吸管小心吸去交换剂上面大部分液体,打开出口使缓冲液Ⅰ恰流到表
面,关闭出口。用毛细吸管小心地沿柱壁四周缓缓加入SOD 粗酶液,打开出口,
使样品溶液进入纤维素内,至几乎露出床面时,柱壁用少量缓冲液小心洗涤2~3
次,然后装入缓冲液Ⅰ,使液面高出创面2~3 cm左右。
5、洗脱
(1)按图将梯度洗脱器和层析柱连接好。
(2)在洗脱瓶A (贮存器)和洗脱瓶B (混合器)内各装入100mL 缓冲液Ⅰ和缓冲液Ⅱ,注意两洗脱瓶,特别是液面应处于同一水平面,同时应排除连接管内气泡。
(3)开动电磁搅拌器开关,调节搅拌速度,以混合器内缓冲液旋转而无明显旋涡为宜。
(4)将两瓶和柱上下连接管道打开,开始收集洗脱流出液,控制流速在1.5mL /min 。 收集液测定蛋白质浓度和酶活性。
(5)收集合并具有SOD 活性部分的洗脱液,透析浓缩后冷冻干燥即得纯化SOD (淡蓝绿色产品)。
【结果与计算】
1、画出层析图谱并标出酶活曲线和线性梯度曲线。
2、计算蛋白回收率、酶活回收率、纯化倍数。
3、求出酶活最高峰时洗脱液盐的浓度。
实验(四) 啤酒酵母的固定化发酵蔗糖实验
【原理】
固定化酶是指限制在一定的空间范围内,可以反复使用的酶制剂,即将制备的酶固定到一定的多孔的载体上,仍能进行其特有的催化反应,使用时将被固定的酶投放到反应溶液中,催化反应结束后又能将被固定的酶回收并可重复使用。20世纪60年代后期,科学家研制成固定化酶,并且用于生产。固定化酶同自由酶相比,具有以下优点:①稳定性高;②酶可反复使用;③产物纯度高;④生产可连续化和自动化等。
将酶提取后再固定化的技术增加了工序和成本。20世纪70年代,科学家研制成固定化细胞,被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。直接固定那些含有所需胞内酶的细胞,并且就用这样的细胞来催化化学反应。
固定包埋法是将微生物细胞用物理的方法包埋在各种载体之中。这种方法既操作简单,又不会明显影响生物活性,是比较理想的方法,目前应用最多。对于包埋法,理想的固定化载体应是:对微生物无毒性;传质性能好,性质稳定,不易被生物分解; 图 梯度洗脱装置示意图 B
强度高、寿命长;价格低廉等。通常选用海藻酸钙、角叉藻聚糖、聚丙烯酰胺凝胶
(ACAM)、光硬化性树脂、聚乙烯醇(PVA) 等。
【试剂和器材】
1、试剂
(1)鲜酵母
(2)海藻酸钠
(3)无水氯化钙
2、器材
烧杯、尼龙布、注射器带7号平针头、搅棒、恒温水浴、试管、分光光度计
【方法和步骤】
1、称取海藻酸钠0.75g 于100mL 烧杯中,加25mL 蒸馏水搅匀,在沸水浴中溶胀15min ,得A 液。
2、取一个50mL 烧杯,加入鲜酵母5g 和25 mL馏水,搅匀,得B 液。
3、待A 液冷却后,将B 液与A 液混合,用尼龙布过滤,得C 液。
4、称取2.2g 无水CaCl2,溶解于200 mL蒸馏水中。
5、用注射器带7号平针头将C 液垂直注入CaCl2溶液中制备固定化细胞,固化30min ,过滤、洗涤,称重。
6、固定化细胞置于100mL 烧杯中,加入0.1mol/L蔗糖液50mL ,35℃保温,间隙搅拌,反应30min 后过滤,除去固定化细胞得酶反应液,冰箱保存、备用。
7、酶活性测定:取1.0mL 上述酶反应液(稀释液),按实验(二)方法,以0.1mol/L蔗糖液为对照,测定还原糖含量。
自选设计实验:
自选实验(一)肾上腺素法测定超氧化物歧化酶的活性
【原理】
肾上腺素法测定SOD 活力
【方法】
将上述提取液、粗酶液和酶液分别取样,测定各自的SOD 活力。
试剂
碳酸缓冲液
EDTA 溶液
蒸馏水
样品液 空白管 5.0 0.5 0.5 - 对照管 5.0 0.5 0.5 - 样品管 5.0 0.5 - 0.5
混合均匀,在30℃水浴中预热5min
肾上腺素溶液 - 0.5 0.5
加入肾上腺素后,继续保温2min ,然后立即在480nm 处测定光密度。对照管和样品管的光密度值分别为A 和B 。
在上述条件下,SOD 抑制肾上腺素自氧化50%所需的酶量定义为一个酶活力单位。
即:酶活力(单位)=2(A-B )N/A
式中N ——样品稀释倍数;2——抑制肾上腺素自氧化50%的换算系数。
【结果与分析】
根据提取液、粗酶液和酶液的酶活力和体积,计算纯化提取率。
自选实验(二)聚丙烯酰胺凝胶电泳检测SOD 的纯度
【目的要求】
(1) 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理
(2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。
【原理】
聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺凝胶为载体的一种区带电泳。该凝胶由丙烯酰胺(Acr )和交联剂
N ,N —甲叉双丙烯聚酰胺(Bis )聚合而成。
Acr 和Bis 单独存在或混合在一起时是稳定的,且具有神经毒性,操作时应戴手套,避免接触皮肤,但在具有自由基团体系时就能聚合。引发自由基团的方法有化学法和光化学法两种。化学法的引发剂是过硫酸胺(Ap ),催化剂是四甲基乙二胺(TEMED );光化学法是以光敏感物核黄素来代替过硫酸胺,在紫外光照射下引发自由基团。采用不同浓度的Acr 、Bis 、Ap 、TEMED 使之聚合,产生不同孔径的凝胶。因此可按分离物质的大小,形状来选择凝胶浓度。
尽管聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE )有圆盘(disc )和垂直板(vertical slab )型之分,但两者的原理完全相同。由于垂直板形具有板薄,以冷却,分辨率高,操作简单,便于比较与扫描的优点,而为大多数实验室采用。
【试剂和器材】
一、试剂
分离胶缓冲液:Tris-HCl 缓冲液 PH8.9:取1N 盐酸48ml ,Tris 36.3g,用无离子水溶解后定容至100ml 。
浓缩胶缓冲液,Tris-HCl 缓冲液 PH6.7:取1N 盐酸48ml, Tris 5.98g,用无离子水溶解后定容至100ml 。
电泳缓冲液,Tris-甘氨酸缓冲液PH8.3:称取Tris 6g, 甘氨酸28.8g, 用无离子水溶解后定容至1L 。用时稀释10倍。
30%Acr -Bis 贮存液:30g Acr,0.8g Bis, 用无离子水溶解后定容至100ml, 不容物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。
考马斯亮蓝R-250
TEMED:10%过硫酸铵(新鲜配制);25%蔗糖溶液;0.05%溴酚蓝溶液,7%冰乙酸溶液。
二、材料
人或动物血清。
三. 器材
夹心式垂直板电泳槽,凝胶膜(135*100*1.5mm),直流稳压电源(电压300-600V ,电流50-100mA, 移液管(1,5,10ml ),烧杯(25,50,100ml ),细长头的滴管,1ml 注射器以及6号长针头,微量注射器(10µL或者50µL),培养皿(直径120mm ),玻璃板(13*13cm),玻璃纸两张,日光灯一台。
【操作方法】
一、 安装夹心式垂直板电泳槽
夹心式垂直板电泳槽操作简单,不易渗漏,这种电泳槽两侧为有机玻璃制成的电极槽,两个电极槽中间夹有一个凝胶膜,该膜由一个U 形硅胶框,长与短玻璃板及样品模槽板所组成。电泳槽由上贮槽,下贮槽和回纹状冷凝管组成,两个电极槽与凝胶模之间靠贮液槽螺丝固定,各部分按下列顺序组装:
1. 装上贮槽和固定螺丝稍钉,仰放在桌面上。
2. 将长短玻璃分别插到硅相框的凹形槽中。注意勿用手接触灌胶面的玻璃。
3. 将已插好玻璃板的凝胶膜平放在上贮槽上,短玻璃板应面对上贮槽。。
4. 将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽,双手以对角线的方式旋紧螺丝帽。
(1) 竖直电泳槽,在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙内加入已融化的1%琼脂,其目的是为了封住空隙,凝固后的琼脂中应该避免有气泡。
(2) 用蒸馏水试验封口处是否漏水。
二、 制备凝胶板
1. 分离胶制备:取Acr-Bis 储备液 5.0ml; Tris-HCl缓冲液 PH8.9 2.5ml;去离子水12.39ml ;TEMED 0.02ml置于小烧杯中混匀,再加入10% 0.2ml过硫酸胺,用磁力搅拌器充分混匀2min 。混合后的凝胶溶液,用细长头的滴管加至长、短玻璃板间的窄缝内,加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm 。用1ml 注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸馏水(约3-4cm ),用于隔绝空气,使胶面平整。为防止渗漏,在上下贮槽中加入略低于胶面的蒸馏水。约30-60min 凝胶完全聚合,则可看到水与凝固的胶
夹心垂直板式电泳槽示意图 凝胶模子示意图 面有折射率不同的界限。用滤纸吸去多余的水,但不要碰破胶面。如需预电泳,则将上下贮槽的蒸馏水1. 导线接头2. 下贮槽3. U 形橡胶框 1. 样品槽模板 2. 长玻璃倒去,换上分离胶缓冲液,10mA 电流电泳1h ,终止电泳后,弃去分离胶缓冲液,用注射器吸取浓缩胶缓4. 样品槽模板 5. 固定螺丝 6. 上贮片 3. 短玻璃片 4. U 形硅
冲液洗涤胶面数次,即可制备浓缩胶。 槽 7. 冷凝系统 胶框
2.浓缩胶制备:取Acr-Bis 1.0ml ;Tris-HCl
缓冲液PH6.7 1.25ml ;去离子水7.64ml ;TEMED 0.01ml ;10%Ap 0.2ml ,用磁力搅拌器充分混匀。混合均匀后用细长头的滴管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内(及分离胶上方),距短玻璃板上缘0.5cm 处,轻轻加入样品槽模板。在上下贮槽中加入蒸馏水,但不能超过短玻璃板的上缘。在距短玻璃板10cm 处用日光灯或太阳光照射,进行光聚合,但不要造成大的升温。在正常情况下,照射6-7min ,则凝胶由淡黄透明变成乳白色,表明聚合作用开始。继续光照30min, 使凝胶聚合完全。光聚合完成后放置30-60min ,轻轻取出样品模槽板,用窄条滤纸吸去样品凹槽中多余的液体,加入稀释10倍的pH8.3的Tris -甘氨酸电极缓冲液,使液面没过短玻璃板约0.5cm ,即可加样。
三、加样
取血清样品0.1ml,25%蔗糖溶液0.1ml,0.05%溴酚蓝溶液0.05ml 混合后,用微量注射器取5µL上述混合液,通过缓冲液,小心的将样品加到凝胶凹形样品槽底部,待所有凹形样品槽内都加了样品,即可
开始电泳。如图
四、电泳
将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接,负极与上槽
连接(方向切勿接错),
接通冷却水,打开电泳仪开关,开始时将电流调至
10mA ,待样品进入分离胶时,
不连续凝胶垂直板电泳示意图
将电流条至20-30mA 。当蓝色染料迁移至距离橡胶况
下缘1cm 时,将电流调回到零,关电源及冷却水。分别收集上下
贮槽电极缓冲液置试剂瓶中,4℃贮存还可用1-2次。旋松固定螺丝,取出硅橡胶框,用不锈钢铲轻轻将一块玻璃撬开移去,在胶板一端切除一角作为标记,将胶板移至大培养皿中染色。
五、染色
将凝胶放入0.05%考马斯亮蓝R250(内含20%磺基水杨酸)染色液中,使染色液没过胶板,染色30min 左右。
六、脱色
用7%乙酸浸泡漂洗数次,直至背景蓝色褪去。如用50℃水浴或脱色摇床,则可缩短脱色时间。脱色液经活性炭脱色后,可反复使用。脱色后电泳区带(血清蛋白质和正常人的唾液蛋白质)如图所示。
【注意事项】
(1) 制备凝胶应选用高纯度的试剂,否则会影响凝胶聚合与电泳效果。
Acr和Bis 是制备凝胶的关键试剂,如含有丙烯酸或其它杂质,则造成凝胶聚合时间延长,聚合不均匀或不聚合,应将它们分别纯化后方能使用。
Acr和Bis 均为神经毒剂,对皮肤有刺激作用,实验表明对小鼠的半致死剂量为170mg/1kg,操作时应戴手套和口罩,纯化应在通风橱内进行。
Acr 的纯化:称70gAcr 溶于1000ml50℃预热的氯仿中,溶解后趁热过滤。冷却后,置-20℃低温冰箱中,则由白色结晶析出,用预冷的布氏漏斗抽滤,收集白色结晶,再用预冷的氯仿淋洗几次,真空干燥后置棕色瓶中密封贮存
Bis 的纯化:称12gBis ,使其溶于1000ml 预热40-50℃的丙酮中,趁热过滤。冷却后,置-20℃低温冰箱中,待结晶析出后,用预冷布氏漏斗抽滤,收集结晶,用预冷丙酮洗涤数次,真空干燥后置棕色瓶中密封保存。
Acr和Bis 的贮液在保存过程中,由于水解的作用而形成丙烯酸和NH 3,虽然溶液放在棕色试剂瓶中,
4℃贮存能部分防止水解,但也只能贮存1-2个月,可测pH 值(4.9-5.2)来检查试剂是否失效。
(2) 由于与凝胶聚合有关的硅橡胶条、玻璃板表面不光滑洁净,在电泳时会造成凝胶板与玻璃板或硅橡胶条剥离,产生气泡或滑胶;拨胶时凝胶板易断裂,为防止此现象,所用器材均应严格的清洗。硅橡胶条的凹槽、样品模槽板及电泳槽用泡沫海绵蘸取洗洁净仔细清洗。玻璃板浸泡在重铬酸钾洗液3-4h 或0.2mol/L KOH 的酒精溶液中20min 以上,用清水洗净,再用泡沫海绵蘸取洗洁净反复清洗,最后用蒸
馏水冲洗,直接阴干或用乙醇冲洗后阴干。
(3) 安装电泳槽和镶有长、短玻璃板的硅橡胶框时,位置要端正,均匀用力或用一旋紧固定螺丝,以免缓冲液渗漏。样品槽模板梳齿应平整光滑。
(4) 用琼脂封底及灌凝胶时不能有气泡,以免影响电泳时电流的通过。
(5) 凝胶完全聚合后,必须放置30min 至1h ,使其充分老化后才能轻轻取出样品模槽板,切勿破坏加样凹槽底部的平整,以免电泳后区带扭曲。
(6) 为防止电泳后区带拖尾,样品中盐离子强度应尽量低,含盐量高的样品可用透析法或凝胶过滤法脱盐。最大加样量不得超过100µg蛋白/100℃µL
(7)在不连续电泳体系中,预电泳只能在分离胶聚合后进行,洗净胶面后才能制备浓缩胶。浓缩胶制备后,不能进行预电泳,以充分利用浓缩胶的浓缩效应。
(8) 电泳时,电泳仪与电泳槽间正、负极不能接错,以免样品反方向泳动,电泳时应选用合适的电流、电压,过高或者过低都会影响电泳效果。
(9)电泳后,应分别收集上下贮槽的电泳缓冲液,在冰箱贮存,可用2-3次。为保证电泳结果满意,虽好使用新稀释的缓冲液。
【思考题】
1. 简述聚丙烯酰胺凝胶聚合的原理,如何调节凝胶的孔径?
2. 为什么样品会在浓缩胶中被压缩成层?
3. 为什么在样品中加含有少许溴酚蓝的40%蔗糖溶液?蔗糖及溴酚蓝各有何用途?
4. 上下两槽电泳缓冲液电泳后,能否混合存放?为什么?
5. 根据实验过程的体会,总结如何做好聚丙烯酰胺垂直板电泳?哪些是关键步骤?
自选实验(三)超氧化物歧化酶的分子修饰
大分子结合修饰(PEG ,月桂酰氯)
自选实验(四)超氧化物歧化酶的固定化