单分子测序助力医学研究

单分子测序助力脆性X综合征的研究[创新技巧]

美国加州大学戴维斯分校（UC Davis）医学院及Pacific Biosciences公司的研究人员利用单分子实时测序技术，对脆性X综合征的关键基因FMR1中的CGG片段扩增进行了测序。他们在第15届脆性X和早发性认知缺损国际研讨会上公布了他们的研究成果。

脆性X综合征（又称Martin-Bell综合征）是一种遗传性综合征。它导致一系列特征性症状，包括生理、智力、情绪、以及行为上的异常。症状的轻重各有不同。该疾病伴随着X染色体上一段三核苷酸序列（CGG）的扩增。这种扩增导致了一种称为FMR1的蛋白质无法在病人体内表达，而该蛋白质是神经正常发育所必需的。

脆性X智力低下（FMR1）基因位于X染色体上，其5’非翻译区（5’UTR）包含了CGG三核苷酸的重复序列。大部分人的CGG片段重复5-44次。CGG片段的扩增与认知力和生殖功能受损相关。如果一个人含有45-54个重复序列，则被认为是“灰色地带”，而55-200个重复序列被称为前突变，200个以上重复序列则被称为全突变。生物通 www.ebiotrade.com

中度CGG重复序列扩增（55-200个CGG重复）可导致脆性X相关性震颤/共济失调综合征（FXTAS），一种以意向性震颤、步态共济失调和其他症状为特征的迟发性神经变性疾病1。而高度CGG重复序列扩增（>200个CGG重复）可引起转录沉默和FMR1编码蛋白（FMRP）的功能丧失，从而导致脆性X染色体综合征1。

由于目前的测序方法都依赖于大量相同拷贝的读取，因而大量扩增的CGG重复（>100）只能生成不连贯的信号（图1）。这阻碍了研究人员获得单碱基分辨率的测序数据。

图1：随着重复扩增数量的增多，生成大量相同的拷贝变得越来越困难。这阻碍了对大部分疾病范围(>100次重复)内重复扩增序列的准确测序。

于是，研究人员利用Pacific Biosciences公司的单分子实时（SMRT）测序技术，试图从大量扩增的CGG重复序列中产生高质量的测序数据（图2）。他们首先利用PCR从人类基因组DNA中扩增出带不同CGG重复的FMR1序列，制备出待测文库。随后加上发夹测序接头，生成闭合的环状测序模板。之后利用Pacific Biosciences RS对样品进行测序。最后采用BLASR算法将长读取装配成环状共有序列（CCS），而目标序列的覆盖度至少为3倍。

结果表明，环状共有序列的读取产生了生理相关范围的重复扩增。而对长的重复等位基因的测序能力似乎仅受读长限制。原始读长超过10 kb，使得环状共有序列覆盖了超过750个CGG重复片段。

图3：一段CGG重复片段范围内的环状共有序列读取图。接近155个重复的峰是SMRT cell被动上样偏向（passive loading bias）与较小插入片段优势的综合结果。示例：环状共有序列读取包含372个CGG重复。

研究人员认为，通过这种方法，如今能够以单碱基分辨率完整鉴定所有与疾病相关的等位基因，从而有利于疾病的准确诊断。 参考文献

1. Oostra, B.A. and R. Willemsen, FMR1: a gene with three faces. Biochim Biophys Acta, 2009. 1790(6): p. 467-77.

2. Eid, J., et al., Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules. Science, 2009. 323(5910): p. 133-8.

Cell：单分子测序揭示惊人的基因组重排

科学家们发现，生活在池塘里的单细胞生物Oxytricha trifallax有一种非凡的能力，它们能在交配时将DNA打碎并快速重排这些片段。这项研究发表在上一期的Cell杂志上。

Oxytricha的基因重排是一个非常精密的过程，“这是大自然早期一种的复杂化尝试，”文章的资深作者，Princeton 大学教授Laura Landweber说。

从实用性的角度看，人们可以将Oxytricha当成模式生物，研究高等动物的染色体重排。在癌症早期，染色体会经历混乱的重排事件，而Oxytricha可以一步步地展现这一过程。

这项研究中的Oxytricha基因组是通过PacBio单分子测序完成的，Pacific Biosciences公司开发的这一技术可以实现超长的测序读取。

Landweber介绍道，Oxytricha与其它微生物截然不同，Oxytricha细胞大约是人类细胞的十倍大，而且拥有两个细胞核。体细胞核含有5%的遗传信息，有转录活性，负责调节细胞的内部活动。而生殖系细胞核保存着要传递给下一代的全部遗传信息，没有转录活性。研究显示， Oxytricha在发育过程中，能通过大规模的程序化DNA重排，将生殖系细胞核转变为体细胞核。

事实上，Oxytricha交配只是为了交换DNA。在营养充足的时候，Oxytricha主要采取无性繁殖，不断地有新细胞出芽。在营养匮乏的时候，两个Oxytricha发生融合并分享遗传信息（交配），拆散并重排

生殖系细胞核的基因和DNA，共同构建拥有一套新染色体的体细胞核。这一过程能让Oxytricha焕发青春活力，也提高了遗传物质的多样性， Landweber说。

在Oxytricha的交配过程中，生殖系细胞核选出大约225,000个小DNA片段，来构建新染色体。Landweber实验室之前的工作表明（2012年的一篇Cell文章和2008年的一篇Nature文章），上一代Oxytricha的数百万非编码RNA引导着上述过程，它们以正确的顺序标记和分选DNA片段。

此外，Oxytricha庞大的基因组也令人印象深刻，Landweber说。2013年她的团队发现，这种生物的体细胞核含有大约16,000染色体，这些染色体大多只含有一个基因。

Oxytricha的独特遗传学机制为DNA提供了很好的保护，有利于将强健的遗传物质传递下去。正因如此，这种生物才能够广泛分布在世界各地。

推荐原文：

The Architecture of a Scrambled Genome Reveals Massive Levels of Genomic Rearrangement during Development

Pacbio RS II 测序平台

一，原理

1. 用4种荧光分别标记4种dNTP

2. 在测序芯片的底部做出许多用与入射光波长相应的小孔，特定的孔径保证了入射光在小孔中只以走很短的矩离。只够照到正好与酶在相互作用的荧光dNTP底物

3. 把聚合酶锚定在测序芯片的底部

4. 让DNA链与酶结合，进行测序

5. 测序时，荧光dNTP与酶+DNA模板型成复合物，短暂结合

6. 荧光dNTP被激光照射，发出荧光，荧光被检测到

7. 酶反应过程，一方面使链延伸，同时使dNTP上的荧光基团脱落

8. 聚合反应持续进行，测序同时持继进行

二，优点：

1. 测长很长，主力的测长可以达到8kb，见下图

2. 可以直接测出碱基修饰，当聚合酶遇到模板上甲基化的A、C等碱基时，聚合的速度明显变慢，并且光谱特征发生改变。这使直接

测甲基化变得很容易，见下图：

3. 对GC含量的偏向性小，可以轻松读到高GC的区段，下图中的紫色曲线就是PacBio的覆盖度。从本质上说，是因为建库中没有PCR过程，所以也就没有因为PCR而引入的

GC bias

4. 测序速度快，上机时，1秒钟测3个碱基。3个小时可以完成一个run。上机前的建库，1天完成，与Illumina或Ion Torrent的建库时间基本持平。所以，整体上，1天建库，1天上机，1天数据分析，3天可以走完一个完整流程

三，应用：

1， 动植物复杂基因组测序

(1)杂合基因组：杂合基因组主要指杂合率高于0.5%的二倍体基因组，如大部分水产类和昆虫等；

(2)高重复基因组：主要指重复序列比例高于50%的二倍体基因组，大部分林木；

(3)超大基因组：基因组大小大于3G，甚至是10G以上的物种，如两栖类，部分林木；

(4)多倍体基因组：如四倍体、六倍体植物等。

2， 真菌基因组完成图

(1) 适用于所有真菌菌株；

(2) 尤其适合超高GC/超低GC真菌;

(3) 其它用传统方法测序比较困难真菌；

(4) 真菌基因组草图或精细图补洞。

3， 细菌基因组完成图

(1) 普通细菌快速完成图构建；

(2) 尤其适合超高GC/超低GC细菌;

(3) 其它用传统方法测序比较困难细菌菌株

通过采用第三代测序技术，直接进行细菌基因组的完成图绘制。 4， BAC克隆完成图

通过PacBio RS平台进行单分子实时测序，可以快速得到超长读长。再加大测序深度，PacBio序列可以产生非常均一覆盖度，在大部

分目标区域内，可以接近100%的覆盖度。

这种方式对于有超高GC含量、超低碱基复杂度等BAC克隆非常具有优势。根据PacBio公司提供的Poster,由1Pacific Biosciences公司和University of Washington, Seattle对人类基因组一个约1.6Mb的片段，总共8个BAC克隆进行了PacBio测序，对比了Illmina测序，总体上得到了非常好的效果。

5， 从头组装（DE Novo Assembly）

PacBio RS平台是目前唯一能完成完整基因组组装，结构测定和基因分型的微生物测序平台。该平台可以用PacBio数据独立完成微生物基因组的完整拼接，也可以将PacBio长读长数据和二代测序短读长数据进行混合拼接完成基因组。

6，甲基化检定

SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进行实时监测的方法。DNA聚合酶催化荧光标记的核苷酸掺入到互补的核酸链中。核苷酸的掺入被检测成荧光脉冲，依据其颜色鉴定出核苷酸。当聚合酶切断连接在核苷酸末端的荧光基团时，脉冲终止。荧光脉冲的到达时间和持续时间产生了关于聚合酶动力学的信息，从而允许直接检测DNA模板链中的修饰核苷酸，包括N6-甲基腺嘌呤、5-甲基胞嘧啶和5-羟甲基胞嘧啶【1】。

【1】参考资料：