实验八 食品蛋白质含量测定

实验八 食品中蛋白质含量测定

1. 实验目的

（1）学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

（2）掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。

2.实验原理

2.1消解

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸在催化剂作用下共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵而留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。

NH2(CH2)2COOH+13H2SO4=(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O 浓硫酸将有机物炭化后为碳、氢与氮，将形成的碳氧化：

2H2SO4+C（Δ）=CO2+2H2O+2SO2↑

生成的二氧化硫将氧化态的氮还原为氨而自身被氧化为三氧化硫，氨随之与硫酸反应生成硫酸铵，

H2SO4+2NH3=(NH4)2SO4

在消解试验中，为了加速蛋白质的分解，缩短消解时间，常常加入下列物质：

（1）硫酸钾：一般浓硫酸的沸点为340℃，但加入硫酸钾后，硫酸不断分解，水不断溢出引起硫酸钾浓度不断增加，沸点因此而增加。

K2SO4+H2SO4=KHSO4

KHSO4（Δ）=K2SO4+H2O↑+SO3

但硫酸钾浓度不能太大，否则消化温度过高会引起铵盐的热分解而释放出氨，

（NH4）2SO4（Δ）=（NH4）2SO4+NH3↑ 2KSO4（Δ）=2H2O+2NH3↑+2SO3↑

除了可以添加硫酸钾之外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等以提高溶液温度，但效果要差于硫酸钾。

（2）硫酸铜：硫酸铜可以催化反应。可以采用的催化剂除了硫酸铜外，还可以加入氧化汞、汞、硒粉以及二氧化钛等，但考虑效果、价格以及污染等原因外，最常用的还是硫酸铜，同时可以加入少量的过氧化氢、次氯酸钾等作为氧化剂以加速有机物的氧化，反应机理为：

2CuSO4（Δ）= Cu2SO4+O2↑+SO2↑ C+CuSO4（Δ）= Cu2SO4+CO2↑+SO2↑

H2SO4+Cu2SO4（Δ）= 2CuSO4+2H2O↑+SO2↑

此反应不断进行，如溶液没有褐色生成（Cu2SO4颜色）而呈现清澈的蓝绿色，说明有机物已经全部被消解完毕。因此，在试验过程中，硫酸铜不但能够催化反应，而且能够指示反应的进行程度。 2.2碱化蒸馏

在消解完全的样品溶液中加入过量的浓的氢氧化钠溶液使溶液呈现碱性，加热蒸馏而放出氨气：

2NaOH+（NH4）2SO4（Δ）= Na2SO4+2H2O+2NH3↑

2.3吸收与滴定

将加热蒸馏释放出来的氨利用硼酸溶液进行吸收，因硼酸属于弱酸，其后再用盐酸进行滴定：

2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

(NH4)2B4O7+5H2O+2HCl=2NH4Cl+4H3BO3 除此之外，也可以用过量的盐酸或者硫酸吸收整流而出的氨气，然后再用氢氧化钠进行回滴。

3. 仪器及材料 3.1仪器

FOSS KjelitecTM 2100 自动定氮仪（含digestor2006消化炉、消化管），酸式滴定管，三角瓶 3.2试剂

硫酸铜（CuSO4·5H20），

硫酸钾，浓硫酸（密度为1.84g/ml），

硼酸溶液（20g/L）， 氢氧化钠溶液（400g/L），

0.01mol/L 盐酸标准滴定溶液，

混合指示试剂：0.1%甲基红乙醇溶液液：0.1%溴甲酚绿乙醇溶液=1:5 3.3 材料

脱脂奶粉 3.4注意事项

（1）样品的取用量应适中，以免影响后续反应。 （2）加入的催化剂硫酸钾和硫酸铜的配比适宜。

（3）催化剂的添加量一定要准确，否则催化速度不一致，导致反应程度和挥发的氨不

一样，误差大。 （4）消化过程中消化的时间应该充分，确保消化完全，消化至溶液呈现透明的浅蓝色。 （5）消化后要将液体充分冷却，定容到容量瓶中备用。

（6）消化之前检查凯氏定氮仪气密性良好，后用蒸馏水清洗凯氏定氮仪，要充分清洗。 （7）消化过程中，加碱液后要迅速关闭进样口，防止反应放出的氨气逸出。

（8）消化过程中，火焰的温度要适当，太小加热过慢，太大容易导致溶液暴沸甚至从

进气口溢出。

4. 实验步骤

5. 结果与分析

5.1计算公式

X=

C(V

1

-V2)⨯0.0140⨯

m

⨯F⨯100

式中：X——样品蛋白质含量（g/100g）；

V1——样品滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）；

V2——空白滴定消耗盐酸标准溶液体积（mL）； c——盐酸标准滴定溶液浓度（mol/L）；

0.0140——1.0mL盐酸[c(HCL)=1.000mol/L]标准滴定溶液相当的氮的质量（g）； m——样品的质量（g）； F——氮换算为蛋白质的系数，一般食物为6.25；乳制品为6.38；面粉为5.70；

高梁为6.24；花生为5.46；米为5.95；大豆及其制品为5.71；肉与肉制品为6.25；

大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83；芝麻、向日葵5.30。

计算结果保留三位有效数字。 5.2实验数据

空白 样品

实验 (-) 1 2

样品质量/g

(-) 0.1930 0.4163

滴定用盐酸体积/ml

1.55 8.30 15.15

蛋白质含量%

(-) 31.2 29.2

X 30.2 (SD=1) 由计算结果可得：样品蛋白质含量为30.2g/100g。

6. 讨论与心得

6.1思考题

6.1.1实验操作过程中，影响测定准确性的因素有哪些？

答：凯氏定氮仪测定蛋白质含量的误差来源可能是样品、催化剂种类和用量、消化的时间、加碱液后的操作、蒸馏加热、清洗凯氏定氮仪的过程、凯氏定氮仪的气密性、氨气是否完全蒸馏出来；硼酸是否封住蒸馏管口、试剂的准确性、滴定终点的判断、滴定盐酸的浓度准确性等。

6.1.2浓硫酸、硫酸钾、硫酸铜的作用是什么？

答：（1）浓硫酸：氧化剂，分解蛋白质成氨气和其他成分。

（2）粉末硫酸钾-硫酸铜混合物（K2SO4: CuSO4·5H2O=3 : 1）：充当催化剂，硫酸

钾可以提高消化液的沸点，硫酸铜作为催化反应的主要成分。 6.1.3在盐酸滴定过程中，能否使用酚酞作为指示剂？为什么？

答：质量分数比5:1的溴甲酚绿—甲基红指示剂的变色范围为：pH5.2以上时，蓝绿色；pH5.0时，淡紫灰到淡蓝色；pH4.8时，带淡蓝色的淡粉红色；pH4.6时，淡粉红。以溴甲酚绿—甲基红作指示剂滴定水样碱度时，终点为淡蓝色变为淡粉红色时，报告的终点pH可记为4.6。酚酞的变色范围是 8.2 ～ 10.0，所以酚酞只能检验碱而不能检验酸。实验需保证滴定终点时碱被完全中和，故不使用酚酞试液，而是用溴甲酚绿—甲基红混合指示剂。这样可以使滴定终点更为准确。

6.2实验心得

这是第八次进行食品分析与检验实验课程。实验内容是掌握凯氏定氮法测定蛋白质含量。其中我主要学会了用FOSS KjelitecTM 2100 自动定氮仪以及凯氏定氮法测食品的蛋白质含量的基本操作技术，掌握了相关实验测定条件的选择，这在以后的食品分析与检验试验中是很有用的。在实验过程中我组成员各有分工，尤其注意了精确观察读数记录、滴定过程的细致操作等一系列基本操作。实验全程我们严格按照规范操作，取得了较好的实验结果。这门课程作为专业课程的配套实验，这是提高我们实验技术，掌握基本的试验方法的基本。我们会更加认真完成课程。

同时感谢老师和助教的讲解，使得我对实验的各项要求目的都有明确的掌握。同时还要感谢同组组员的合作配合，使得我们在短时间内就按照要求完成了所有实验要求。我相信我们的配合会更加娴熟，相信实验课会越来越顺利。

由于水平有限，实验报告中定有纰漏错误之处，请老师不吝赐教！