碱性磷酸酶测定方法(磷酸苯二钠比色法)
磷酸酶
磷酸酶能酶促有机磷化合物的水解。试验表明,土壤微生物对于土壤含磷有机物的矿化起着主要的作用;某些高等植物的根系也有磷酸酶活性。土壤的磷酸酶活性可以表征土壤的肥力状况(特别是磷的状况)。
基本原理:
土壤磷酸酶活性的测定常用各种磷酸酯作为基质。应用得最多的是酚酞磷酸酯、苯磷酸酯、甘油磷酸酯、ɑ-或ß-萘磷酸酯和p-硝基苯磷酸酯等的水溶性钠盐。当它们被酶促水解时,能析出无机磷和基质的有机基团。因此磷酸酶活性的测定时测定基质水解后的无机磷或酚的部分。这里介绍的方法是测定基质水解时生成的酚量。该法可用于测定各种磷酸酶的活性:碱性磷酸酶(用PH10的硼酸盐缓冲液),中性磷酸酶(用PH7.0的柠檬酸盐缓冲液),酸性磷酸酶(用PH5.0的乙酸盐缓冲液)
试剂配制:
1) 甲苯
2) 0.5% 磷酸苯二钠
3)硼酸盐缓冲液(PH9.6与PH10.0):称取12.404g 硼酸(H 3BO 3)溶于700ml 去离子水,用稀NaOH 溶液调节至PH10.0,用去离子水稀释至1000ml
4) 氯代二溴对苯醌亚胺试剂:取0.125g 2,6-二溴苯醌氯酰亚胺,用10ml 96%的乙醇溶解,贮于棕色瓶中,存放在冰箱里。保存的黄色溶液未变褐色之前均可使用。
5) 标准溶液:(a )母液:1g 酚溶于蒸馏水中,并稀释至1000ml ,溶液保存在暗色瓶中;(b )工作液:10ml 溶液(a )稀释至1000ml (1ml 含10ug 酚) 6)0.3%硫酸铝溶液
标准曲线绘制:
取0,1,3,5,7,9,11和13ml 酚工作液(b ),置于50ml 容量瓶中,每瓶加入5ml 缓冲液和4滴氯代二溴对苯醌亚胺试剂,显色后稀释至刻度,30min 后比色测定。以光密度为纵坐标,浓度为横坐标绘成标准曲线。
操作步骤:
1)取5g 风干土置于200ml 三角瓶中,用2.5ml 甲苯处理
2)处理15min 后,加入20ml 0.5%磷酸苯二钠
3)将反应混合物置于37℃恒温箱中,培养24h 后,在培养液中加100ml 0.3%硫酸铝溶液用致密滤纸过滤。
4) 无土对照:不加土样,其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度,整个实验设置一个对照
5) 无基质对照:对每个土样,设置以等体积的水代替基质,其他操作与样品实验相同。
6)比色程序:
取滤液3ml 置于50ml 容量瓶中,然后按绘制标准曲线所述方法显色。用硼酸缓
冲液时,呈现蓝色,在分光光度计上于660nm 处比色。
结果计算:
磷酸酶活性,以24h 后1g 土壤中释出的酚的毫克数表示:
酚(mg )=a ×8
式中,a ——从标准曲线上查得的酚毫克数
8——换算成1g 土的系数
以24h 后1g 土壤中释放出的酚的质量(mg )表示磷酸酶活性。 磷酸酶活性=(a 样品-a 无土-a 无基质)×V ×n /m 式中:a 样品为样品吸光值由标准曲线求得的酚毫克数;
a 无土为无土对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数;
a 无基质为无基质对照吸光值由标准曲线求得的酚毫克数;
V 为显色液体积;n 为分取倍数,浸出液体积/吸取滤液体积;m 表示烘干土重