rhIL_12二硫键_N_糖基化位点及C端氨基酸序列分析_赵峰
中国生物工程杂志ChinaBiotechnology，2014，34（5）：39-53
DOI：10．13523/j．cb．20140506
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技术与方法
上发挥重要的作用，这些多数是CHO细胞表达的糖蛋白，对糖蛋白的理化特性分析是保证产品质量的重要内容。糖蛋白中的糖基化对其生物学功能起着非常重要的作用。其中糖基化位点的鉴定分析是糖基化分析的重要组成部分，这有助于进一步揭示糖蛋白的生物以及产品质量控制方面起着重要的作用。基学特性，
因工程药物的氨基酸序列与二硫键配对是否正确与蛋尽管在质量控制白质的生物活性也具有密切相关性，
中对二硫键配对分析以及C端氨基酸序列分析在常规
03-1104-08收稿日期：2014-修回日期：2014-*国家科技部中小企业创新基金资助项目（10C[1**********]）＊＊通讯作者，电子信箱：tlihj@jnu．edu．cn
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rhIL－12二硫键、N－糖基化位点及
C端氨基酸序列分析*
赵峰
1
张宜俊
2
冉艳红
1
王兴勇
2
叶倩君
2
李弘剑
1＊＊
（1暨南大学生命科学技术学院广州5106322广州市恺泰生物科技有限公司广州510663）
摘要12）是一种已经用于治疗肿瘤，重组人白细胞介素12（rhIL-寄生虫、病毒性感染及造血障碍
等疾病研究的异二聚体糖蛋白。结构确证是质量控制的重要内容，此研究对CHO细胞表达的rhIL-12二硫键配对方式、N-糖基化位点以及C端氨基酸序列进行了分析，使用Trypsin、Chymotrypsin和Glu-C三种酶分别对rhIL-12进行非还原酶解，尽可能地在其所有半胱氨酸残基之MS/MS对酶解后的肽段样品进行分析，间断裂而形成二硫键相连的肽段，然后使用LC-确定了rhIL-12样品中存在和理论配对方式相符的7对二硫键。将rhIL-12二硫键还原后并烷基化修饰MS/MS对酶解后肽段进行了质保护，分别采用Trypsin，Chymotrypsin和GluC进行酶解，并用LC-12p35亚基C端氨基酸序列的8个氨基酸、p40亚基谱肽图及C端氨基酸序列分析，确定了rhIL-C端氨基酸序列的15个氨基酸。对rhIL-12样品还原及烷基化后用Trypsin变性酶解，所得肽段
18
在H2O及H2O水中分别用PNGaseF糖苷酶处理酶切产物。并通过二级质谱分析脱糖后糖肽
12的3个N糖基化修饰位点，从而确定了rhIL-分别为p35亚基的71位和85位以段分子量变化，
12的二硫键位及p40亚基的200位。通过建立酶解结合二级质谱鉴定的方法，证明了新药rhIL-C端氨基酸序列和糖基化位点与理论一致。点、关键词
rhIL-12
Q517
但是在申报注册药物时在质量检定项目中没有规定，研究中应尽可能分析清楚。
IL-12是由两个不同基因编码的蛋白亚单位组成12p40和IL-12p35两个亚单位的异源二聚体蛋白。IL-12p70。其通过二硫键相连，构成具有生物学功能的IL-中p40由306个氨基酸组成，包含10个半胱氨酸残基和4个潜在的N-糖基化位点。p35由197个氨基酸组成，包含7个半胱氨酸残基和3个潜在的N-糖基化位点
［1］
二硫键N-糖基化位点C端氨基酸序列LC-MS/MS
中图分类号
目前，已经有许多生物技术生产的糖蛋白在临床
。目前IL-12是免疫网络中重要的核心细胞因子，
是连接先天固有免疫与后天获得性免疫的桥梁，它可T细胞增殖和发挥细诱导Th0分化，并通过NK细胞、胞毒性作用以及诱生IFN-γ从而增强机体的细胞免疫功能
［2］
。而在骨髓中，12作间充质干细胞也能分泌IL-
［3］
为相关造血因子，参与调节骨髓造血。IL-12是一种C18），（ThermocolumnSC20075μm*100mm（ＲP-Fisher）；Zorbax300SB-C18购自AgilentTechnologies。1．3
二硫键位点分析方法
12含有17个半胱氨酸，理论上IL-其中p35有7Cys174，个半胱氨酸，形成2个分子内二硫键：Cys42-Cys63-Cys101；而Cys15，Cys88为游离的半胱氨酸。p40有10个半胱氨酸，形成4个分子内二硫键：Cys28-Cys100-Cys120，Cys148-Cys171，Cys278-Cys305，Cys68，
一个游离Cys252；分子间二硫键在p35的Cys74和p40的Cys177之间。
12样品蛋白在避免二硫键重排或交换的将rhIL-chymotrypsin或Glu-C进行酶条件下，分别用trypsin、12进行非还原酶解，切，对rhIL-尽可能地在其所有半胱氨酸残基之间断裂而形成二硫键相连的肽段；然后并用质谱鉴定分离所得的色谱分离这些肽段混合物，
各个肽段；通过匹配所得到的MS/MS图谱，从而找到二硫键相连的肽段并确定二硫键配对方式。1．3．1
样品处理及酶解
（1）采用Bradford法对除盐
12样品进行蛋白定量。后的rhIL-（2）GluC非还原性酶解：取20μgrhIL-12样品，复150mmol/LTris中，加入1μg溶于50μl1．5mol/Lurea、GluC25℃酶解反应20h。
（3）Chymotrypsin非还原性酶解：取20μgrhIL-12150mmol/LTris中，样品，复溶于50μl1．5mol/Lurea、加入1μgChymotrypsin37℃酶解反应20h。
（4）LysC/Trypsin非还原性酶解：取20μgrhIL-12150mmol/LTris中。加样品，复溶于50μl8mol/Lurea、C，25℃酶解反应3小时。然后加入25mM入1μgLys-NH4HCO3将urea浓度稀释至至1．5mol/L左右，加入1μgTrypsin37℃酶解反应20h。
（5）GluC/Trypsin非还原性酶解：取20μgrhIL-12150mmol/LTris中，样品，复溶于50μl1．5mol/Lurea、加入1μgGluC和1μgTrypsin37℃酶解反应20h。1．3．2质谱测试
（1）酶解肽段的液相色谱分离：对酶
解后的肽段通过EttanMDLC进行液相色谱分离，流动B液为0．1%甲酸的乙相：A液为0．1%甲酸的水溶液，
腈水溶液（其中乙腈浓度为84%）。上样及洗脱：色谱柱以95%的A液平衡后，样品由自动进样器上样到Trap柱。分离梯度为：0min～50min，B液线性梯度从4%到50%；50min-54min，B液线性梯度从50%到100%；54min～60min，B液维持在100%。
（2）质谱测试分析：酶解后的肽段通过GE公司的
12即可新型的造血因子，动物实验证明，低剂量的IL-促进早期造血干细胞增殖分化，促进受辐射损伤的小使其造鼠或放化疗后的荷瘤小鼠三系血细胞的恢复，血系统得以修复与重建
［4-5］
。目前对rhIL-12的研究主
要集中于恶性肿瘤、抗病毒、抗寄生虫，造血功能恢复12的临床试验有一百多项，有单独等领域。并且rhIL-联合使用和作为佐剂使用。使用、
12在避免二硫键重排或交换的条件本文对rhIL-chymotrypsin、Glu-C进行非还原酶分别用trypsin、下，
解，尽可能地在其所有半胱氨酸残基之间断裂而形成并二硫键相连的肽段；然后色谱分离这些肽段混合物，用MS/MS鉴定分离所得的各个肽段；通过匹配所得到12二硫键的配对方式。的MS/MS图谱，确定了rhIL-用PNGaseF糖苷酶可以移除糖蛋白中全部N多聚糖，天冬酰胺（ASN）转化成天冬氨酸（ASP），脱酰胺的ASN残基可以间接提供N糖基化位点的线索。然而，因为天冬酰胺的脱酰胺作用是体内常见修饰并且在体容易错误鉴定N糖基化位点，我们外也会自发脱酰胺，
通过PNGaseF糖苷酶切除糖链后，在H2O中会使天冬分子量会增加酰胺（ASN）转化成天冬氨酸（ASP），
0．9840Da。而在H218O中会使ASN分子量增加2．9890Da。根据这一特点结合质谱分析可以增加N-糖基化位点的鉴定准确度
［6-10］
，12的N-从而确证了rhIL-糖
12样品使用Trypsin、Chymotrypsin和基化位点。对rhIL-Glu-C分别对蛋白质样品进行酶解，MS/MS然后使用LC-（LTQ-Velos）对酶解后的肽段样品进行分析，用Bioworks3．3软件（Sequest算法）对LC-MS/MS数据进行12的C端氨基酸序列符合理论序列。分析，确定了rhIL-
1
1．1
材料方法
仪
器
4800PlusMALDITOF/TOF质谱仪（Applied
Biosystems）；LTQ-Velos液质联用双压线性离子阱质谱仪（ThermoFinnigan）；EttanMDLC多维液相色谱系统（GEHealthcare）。1．2
材料与试剂
Urea，Tris-base，SDS，DTT，HCCA购自Bio-Ｒad公Chymotrypsin，Lys-C，Trypsin，PNGase司；蛋白酶：GluC，
F购自Sigma公司；Bioworks3．3软件购自ThermoFisher；色谱柱：TraPcolumn：EASYcolumnSC001trapsC18）、Analysiscolumn：EASY150μm*20mm（ＲP-
EttanMDLC进行分离后，再通过ThermoLTQ进行测试。ThermoLTQVELOS测试相关参数如下：采用TrapC18，柱：Zorbax300SB-进样方式为Microspray；毛细管温度设定200℃；正离子方式检测。1．3．3
数据库检索及匹配分析
通过匹配MS/MS图
谱，确定二硫键的链接方式，根据样品理论序列建立的蛋白库进行数据库的检索，二硫键肽段MS/MS图谱由从而确定二硫键位点。人工进行匹配，1．4
N-糖基化位点分析方法
IL-12p40亚基包含4个潜在的N连接糖基化位点；p35亚基包含3个潜在的N连接糖基化位点；在p40上至少有一个位点是糖基化的。我们通过蛋白质12的N型糖基化位组学的方法对重组人白细胞介素-点进行确证。
一般发生N-糖基化位点修饰的蛋白，都有基本的氨基酸结构骨架为：天冬酰胺X丝氨酸（NXS）或天冬再酰胺X苏氨酸（NXT）的结构。用蛋白酶酶解蛋白，用PNGaseF糖苷酶切除链接在天冬酰胺（ASN）上的在水中会使ASN转化成天冬氨酸（ASP），分子量糖链，
18
增加0．9840Da。在O水中会使ASN分子量增加
nm波长的Nd：YAG激光器，加速电压为2kV，采用正PMF质量离子模式和自动获取数据的模式采集数据，扫描范围为800～4000Da。对一级质谱分析初步确认进一步确认含有糖的肽段样品再进行二级质谱分析，
基化位点肽段的序列。选择母离子进行二级质谱（MS/MS）分析，二级MS/MS激光激发2500次，碰撞能量2kV，CID关闭。1．5
质谱肽图及C端氨基酸测序
Trypsin，Chymotrypsin和Glu-C酶解
各取
1．5．1
50μgrhIL-12样品溶解于100mmol/LNH4HCO3，经过DTT和IAA反应后，将二硫键还原后并烷基化修饰保护，加入Trypsin，Chymotrypsin和GluC各1μg，37℃20h。1．5．2
毛细管高效液相色谱分离肽段及质谱鉴定
酶解后的肽段通过EttanMDLC进行毛细管高效液相分Velos进行测试。酶解及质谱离，再通过ThermoLTQ-鉴定相关参数同二硫键检测方法中1．2．2部分。
对质谱鉴定多肽和多肽的碎片的质量电荷比按照下列方法采集：每次全扫（fullscan）后采集20个碎片
2
图谱（MSscan）。
2．9890Da。通过检测脱糖后糖肽段分子量变化，从而确定该蛋白质糖基化的位点。1．4．1
样品变性及PNGaseF脱糖反应
取50μg样品
加入45μl25mmol/LNH4HCO3，再加入5μl变性剂（（0．2%SDSwith100mmol/LDTT），沸水浴10min，冷37℃3h或过却至室温。加入1UPNGaseF（Ｒoche），
夜。对照为SDS变性后未脱糖样品（不加PNGaseF，其他处理方法相同）。通过PNGaseF糖苷酶酶切SDS变性样品，从而去除蛋白的N糖链，取部分样品，以SDSPAGE实验。从而变性后未脱糖样品为对照进行SDS-确定样品PNGaseF糖苷酶的脱糖效果，以进行后续检测。1．4．2
Trypsin蛋白酶消化及肽段脱糖反应
取50μg
12样品用Trypsin变性酶解还原及烷基化rhIL-（Trypsin：rhIL-12=1∶50），37℃酶解18h。凝集素富集37℃放置3h，回收肽糖基化肽段并加入1UPNGaseF，
18
段。所得肽段在水及O水中分别用PNGaseF糖苷酶
1．5．3质谱数据处理LTQ-Velos产生的原始数据由
Bioworks3．3软件查库，搜索使用的数据库为根据样品数据筛选参数为：Xcorr≥1．9理论序列建立的蛋白库，
（Charge1），Xcorr≥2．2（Charge2）和Xcorr≥3．75（Charge3）。
2
2．1
结果
二硫键分析结果
12各个二硫键测试图谱匹配分析图谱如将rhIL-
图1～图7所示。
从图1匹配分析得到p35分子内两条二硫键链接肽段分别是35～54位：QTLEFYPC（﹩42）TSEEIDHEDITK和173～181位：LC（﹩174）TLLHAFＲ。Cys174之间形成的二从而确定了p35分子内Cys42-硫键。
从图2匹配分析得到p35分子内两条二硫键链接肽段分别是94～110位肽段：TSFMMALC（﹩101）LSSIYEDLK和54～70位肽段：TSTVEAC（﹩63）LPLELTK。从而确定了p35分子内Cys63-Cys110之间形成的二硫键。
从图3匹配分析得到p40分子内两条二硫键链接28）DTPEEDGITW和肽段分别是27～38位肽段：TC（﹩
处理酶切产物。1．4．3
质谱分析
上述肽段通过一级质谱分析初步
确认可能含有糖基化位点的肽段。样品与5mg/mlHCCA基质1∶1混合后，用4800PlusMALDITOF/TOF串联飞行时间质谱仪进行质谱分析，激光源为355
图1
Fig．1
p35Cys42与Cys174的二硫键分析图
Disulfidebondanalysischartofp35Cys42andCys
174
图2
Fig．2
p35Cys63与Cys101的二硫键分析图
Disulfidebondanalysischartofp35Cys63andCys101
67～75位肽段：TC（﹩68）HKGGEVL。从而确定了p40Cys68之间形成的二硫键。分子内Cys28-从图4匹配分析得到p40分子内两条二硫键链接肽段分别是118～135位肽段：FTC（﹩120）WWLTTISTDLTFSVK和109～112位肽段：C（﹩109）EAK。从而确定了p40分子内Cys109-Cys120之间形成的二硫键。
从图5匹配分析得到p40分子内两条二硫键链接148）肽段分别是139～157位肽段：GSSDPQGVTC（﹩GAATLSAEＲ和167～173位肽段：YSVEC（﹩171）QE。Cys171之间形成的二从而确定了p40分子内Cys148-硫键。
从图6匹配分析得到p40分子内两条二硫键链接肽段分别是292～306位肽段：YYSSSWSEWASVPC（﹩305）S和272～279位肽段：TSATVIC（﹩278）Ｒ。从而确Cys305之间形成的二硫键。定了p40分子内Cys278-从图7匹配分析得到p40与p35分子间两条二硫键链接肽段分别是p40中174～182位肽段：DSAC（$177）PAAEE和p35中73～79位肽段：SC（$74）LNSＲE。从而确定了分子间p35的Cys74与p40的Cys177形成的二硫键。
12存在和理论通过二硫键测试分析得出结论：rhIL-配对方式完全相符的7对二硫键：分别是：p35分子内二Cys63-Cys101；p40分子内二硫键硫键：Cys42-Cys174，
图3
Fig．3
p40Cys28与Cys68的二硫键分析图
Disulfidebondanalysischartofp40Cys28andCys
68
图4
Fig．4
p40Cys109与Cys120的二硫键分析图
Disulfidebondanalysischartofp40Cys109andCys
120
图5
Fig．5
p40Cys148与Cys171的二硫键分析图
Disulfidebondanalysischartofp40Cys148andCys171
图3
Fig．3
p40Cys28与Cys68的二硫键分析图
Disulfidebondanalysischartofp40Cys28andCys
68
图4
Fig．4
p40Cys109与Cys120的二硫键分析图
Disulfidebondanalysischartofp40Cys109andCys
120
图5
Fig．5
p40Cys148与Cys171的二硫键分析图
Disulfidebondanalysischartofp40Cys148andCys171
图6
Fig．6
p40Cys278与Cys305的二硫键分析图
Disulfidebondanalysischartofp40Cys278andCys305
图7
Fig．7
p35Cys74与p40Cys177的二硫键分析图
Disulfidebondanalysischartofp35Cys74andp40Cys177
Cys28-Cys68，Cys109-Cys120，Cys148-Cys171，Cys278-Cys305；和分子间二硫键p35的Cys74和p40的Cys177。
12在二硫键位从而说明CHO细胞重组表达的IL-点和二硫键连接方式上与文献报道完全一致。曾有文
［11］
献认为p35的Cys15与Cys88可能形成二硫键，但
Christina等［1］通过X晶体衍射分析IL-12结构，发现Cys15与Cys88为游离的半胱氨酸。二硫键与蛋白质高级结构的生物活性有关，通过二硫键测试分析证实12了7对二硫键与理论完全相符合，这也表明刺rhIL-在高级结构二硫键连接上的正确性，从而保证了产品的质量。2．22．2．1
rhIL-12糖基化分析结果
PAGE检测脱糖前后样品进行SDS-rhIL-
12
Fig．8
图8
rhIL-12脱糖前后SDS-PAGE图
1：rhIL-12beforeDeglycosylation；2：rhIL-12afterDeglycosylation；M：Marker
DeglycosylatedrhIL-12bySDS-PAGEanalysis
PAGE结果见图8，2为IL-12脱糖前后进行SDS-图中1，PAGE脱糖后蛋白脱糖前后样品，可以看出还原性SDS-P40与P35亚基分子量下降，实验表明，脱糖效果比较理想，脱糖处理样品能够进入质谱实验进行进一步分析。2．2．2MALDI-TOF质谱分析可能发生糖基化位点肽段TOF一级质谱检测各肽段在H2O及H218O中通过MALDI-脱糖后分子量，初步确定了四个肽段为位点糖基化肽段，TOF一级质谱结共计三个糖基化位点，脱糖前后MALDI-果如图9所示。三个糖基化位点肽段分析结果列于表1。
根据N糖在H2O中脱糖反应后ASN转化成
18
ASP，分子量相差2．989Da，从图9和表1中看出，MALDI-TOF质谱检测到其中3个位点的4条糖基化肽段。肽段1：TSTVEACLPLELTKNESCLNSＲ在H2O及H218O中脱糖后分子量分别为2523．23和2525．20；肽
18
段2：ETSFITNGSCLASＲ在H2O及H2O中脱糖后分子
量分别为1543．73和1545．71；肽段3：YENYTSSFFIＲ
18
在H2O及H2O中脱糖后分子量分别为1427．67和
1429．65。肽段4：LKYENYTSSFFIＲ在H2O及H218O中脱糖后分子量分别为1668．81和1670．80
。
图9
Fig．9
18
TOF分子量比较各肽段在H2O及H2O中脱糖后MALDI-
MALDITOFanalysisoftheglycopeptideswhichweredeglycosylatedinH2OandH218Orespectively
2．2．3二级质谱分析确认糖基化位点所在肽段序列ASP，分子量差2．989Da
18
肽段2：ETSFITNGSCLASＲ在H2O中脱糖肽段二
为此对一级质谱初步确认的糖基化位点肽段进行二级质谱确证分析。
18
肽段1：TSTVEACLPLELTKNESCLNSＲ在H2O中
级质谱分析见图11。
18
通过匹配分析从而进一步确定了此肽段在H2O
脱糖肽段二级质谱分析见图10。通过匹配分析从而进
18
一步确定了此肽段在H2O中脱糖反应后分子量为
N糖在H218O中中脱糖反应后分子量为2525．21Da，
分子量差2．989Da脱糖反应后ASN转化成ASP，
2525．21Da，N糖在H218O中脱糖反应后ASN转化成
表1
Table1
三个位点糖基化肽段分子量
MolecularWeightof3peptidescontainingN-glycosylationsites
理论分子量2522．221542．721426．661667．84
理论脱糖后分子量H2O2523．201543．701427．641668．82
H218O2525．211545．711429．651670．83
实测分子量H2O2523．231543．731427．671668．82
H218O2525．201545．711429．651670．
83
肽段序号
1234
肽段序列
TSTVEACLPLELTKNESCLNSＲ（p35）
ETSFITNGSCLASＲ（p35）YENYTSSFFIＲ（p40）LKYENYTSSFFIＲ（p40）
图10
Fig．10
18
肽段1在H2O中脱糖肽段二级质谱分析图谱
Identificationoftheglycopeptides1inH218Obytandemmass
spectrometry
图11
Figu．11
18
肽段2在H2O中脱糖肽段二级质谱分析图谱
Identificationoftheglycopeptides2inH218Obytandemmassspectrometry
18
肽段3：YENYTSSFFIＲ在H2O中脱糖肽段二级18
通过匹配分析从而进一步确定了此肽段在H2O
质谱分析见图12。
18
通过匹配分析从而进一步确定了此肽段在H2O
N糖在H218O中中脱糖反应后分子量为1670．83Da，
脱糖反应后ASN转化成ASP，分子量差2．989Da
并通过二级质谱图谱中的离子匹配分析，确定了四条肽段的准确性，通过四条肽段确定了3个N糖基化修饰位点。分别为p35亚基的71位和85位以及p40亚基的200位
。
N糖在H218O中中脱糖反应后分子量为1429．65Da，
脱糖反应后ASN转化成ASP，分子量差2．989Da
18
肽段4：LKYENYTSSFFIＲ在H2O中脱糖肽段二
级质谱分析见图13。
图12
Fig．12
18
肽段3在H2O中脱糖肽段二级质谱分析图谱
Identificationoftheglycopeptides3inH218Obytandemmass
spectrometry
图13
Fig．13
18
肽段4在H2O中脱糖肽段二级质谱分析图谱
Identificationoftheglycopeptides4inH218Obytandemmassspectrometry
2．2．4糖基化位点分析结论我们通过SDSPAGE电18
酶解后肽段分别在H2O及H2O中脱糖，经一级
泳检测脱糖及未脱糖样品，表明该样品含有N糖基化修饰，且p35亚基和p40亚基均含有N糖基化修饰位点。PNGaseF糖苷酶脱糖效果较理想。
质谱分析初步确认了3个理论N-糖基化修饰位点所在肽段。通过二级质谱分析进一步确认N-糖基化修饰位点所在肽段序列与理论序列一致。
综上所述，我们证明重组人白细胞介素12中含有
图分析
Chymotrypsin和Glu-在使用三种酶（Trypsin、
3个N糖基化修饰位点，分别为p35亚基的71位和85位以及p40亚基的200位。此3个N糖基化修饰位点均是理论上可能形成的位点，并且p40亚基的200位糖糖基化位点。基化位点是已经证实的N-2．32．3．1
rhIL-12质谱肽图及C端序列分析结果
Chymotrypsin和Glu-C质谱肽三种酶Trypsin、
12进行溶液内酶解后，C）分别对rhIL-得到的肽段样品，经过LCMSMS设备的分析，得到的原始数据经过BioworksTM（Sequest算法）（ThermoFisher）进行查库，所12理论氨基酸序列。rhIL-12的三使用的数据库rhIL-种酶酶解后的色谱质谱图（Basepeak图谱）见图14～图16。三种酶酶解所得匹配肽段分析结果见表2，表3
。
图14Fig．14
rhIL-12的Chymotrypsin内切酶酶解后的LCMSMS（basepeak）图谱LC-MS/MStandemmassspecturmofrhIL-12cleavedby
Chymotrypsin
图15Fig．15
rhIL-12的Glu-C内切酶酶解后的LCMSMS（basepeak）图谱LC-MS/MStandemmassspecturmofrhIL-12cleavedbyGlu-C
结合以上三种蛋白质内切酶的试验结果，对rhIL-12p35亚基的肽段序列覆盖率为94．42%，p40亚基的
肽段序列覆盖率为88．24%。因此可以看出，对供试品的酶解后LCMSMS试验达到了理想的效果。
图16Fig．16
rhIL-12的Trypsin内切酶酶解后的LC-MS/MS（basepeak）图谱LC-MS/MStandemmassspecturmofrhIL-12cleavedbyTrypsin
表2
Table2
rhIL-12P35亚基质量肽图分析结果
ＲesultsofpeptidesmassmappingofrhIL-12p35
实测相对分子质量
（measuredrelativemolecularmass）1414．642557．95890．072641．83975．043038．341748．022408．712020．311858．011528．661485．631952．331301．462309．811373．591166．321970．071220．591085．36884．01
理论相对分子量（theoreticalrelativemolecularmass）1414．642557．97890．072641．84975．043038．351748．022408．722020．301858．011528．661485．631952．341301．482309．811373．591166．321970．081222．601085．38884．01
序列位置（position）1-132-2425-3235-5639-4640-6655-7057-7862-7967-8276-8979-9294-110107-116116-134133-144144-153151-167167-176173-181190-197
肽段序列（Sepuence）ＲNLPVATPDPGMF
NLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLＲ
AVSNMLQK
QTLEFYPCTSEEIDHEDITKDK
FYPCTSEE
YPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPL
DKTSTVEACLPLELTKTSTVEACLPLELTKNESCLNSＲACLPLELTKNESCLNSＲEELTKNESCLNSＲETSFNSＲETSFITNGSCLETSFITNGSCLASＲTSFMMALCLSSIYEDLK
EDLKMYQVEFFKTMNAKLLMDPKＲQIFLD
LDQNMLAVIDELLMQALNFNSENSETVPQKSSLEEPDFY
YKTKIKLCILLCILLHAFＲVMSYLNAS
2．3．2rhIL-12样品C端序列其中Trypsin酶解后的标准的要求（Xcorr≥2．2）。得到和P40理论C端序列（YYSSSWSEWASVPCS）相符合的MS2图谱（见图18），Xcorr得分为4．463，此MS图谱为2电荷离子，超过可信标准的要求（Xcorr≥2．2）。
2
rhIL-12样品经过LCMSMS分析后，得到和P35理论C
2
端序列（VMSYLNAS）相符合的MS图谱（见图17），此
MS2图谱为2电荷离子，Xcorr得分为2．314，超过可信
表3
Table3
肽段序列（Sepuence）IWELKLKKDVYVVELDWYPDAPGEDWYPDAPGEMVVLMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEDQSSEVLGSGKTL
TLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHK
HKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTF
LＲCEAKNYWLTTISTDL
LTFSVKSSＲGSSDPQGVTCGAATLSAE
ＲVＲGDNKEYEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYE
AVHKLKYEIＲDIIKPDPPKNLNLQLKPLKNSＲKNSＲQVEVSWEYPDTWVFTDKTSATVICＲK
KNASISVＲＲYYSSSWSEYYSSSWSEWASVPCS
rhIL-12P40亚基质量肽图分析结果
ＲesultsofpeptidesmassmappingofrhIL-12p40
实测相对分子质量（measuredrelativemolecularmass）
687．841092．281162．211491．671236．431351．381320．40801．971355．421502．761012．131892．13996．141049．192656．901265．321149．20891．891971．34987．151518．811310．542024．171568．83874．011164．191738．84
理论相对分子量（theoreticalrelativemolecularmass）
687．841092．301162．221491．681236．421351．391320．42801．981355．451502．781012．131892．14996．151049．192656．911265．351149．19891．911971．35987．171518．821310．562024．181568．86874．011164．201738．85
序列位置（position）1-54-1213-2214-2623-3334-4541-5352-5859-7071-8483-9091-106107-114122-130130-156157-166165-173174-182183-199198-208207-219218-228225-240267-280280-287291-299292-
306
图17
Fig．17
rhIL-12p35亚基C端序列（VMSYLNAS）的MS2图谱
MS2spectrumoftheC-terminalsequenceofIL-12p35subunit（VMSYLNAS）
图18
Fig．18
rhIL-12p40亚基C端序列（YYSSSWSEWASVPCS）的MS2图谱
MS2spectrumoftheC-terminalsequenceof18rhIL-12p40subunit（YYSSSWSEWASVPCS）
2．3．3C端氨基酸序列分析结论经LCMSMS分别琐，精确度低，成功率低，很难确定复杂蛋白质样品的二硫键配对方式。后来随着质谱的出现，应用MALDI-TOF分析还原性与非还原性酶解后的肽段混合物的质量肽谱图，确定二硫键相连肽段的分子量，肽段覆盖率较低，约40%左右，只能找到少数二硫键。另外处于一级质谱水平，可信度大打折扣。
采用更先进的液质联用质谱技术与多酶解相结合的方法
［12］
Chymotrypsin和Glu-C对rhIL-12酶解后分析Trypsin、
rhIL-12p35亚基的肽段序的肽段样品，通过匹配分析，p40亚基的肽段序列覆盖率为列覆盖率为94．42%，
88．24%。可以看出，rhIL-12的酶解后LCMSMS试验达到了理想的效果。
12样品经过LCMSMS其中Trypsin酶解后的rhIL-分析后，得到和P35理论C端序列（VMSYLNAS）相符
2
合的MS图谱，得到和P40理论C端序列
，确定二硫键的配对方式。采用Trypsin，
Chymotrypsin和GluC三种酶进行酶解，其中Trypsin可Chymotrypsin可以对以对Arg和Lys位点进行酶解，
Tyr，Trp，Phe，Leu和Met位点进行酶解，GluC可以对Asp和Glu位点进行酶解，采用不同的蛋白酶多酶解增加了酶解位点，从而提高了酶解的效果，例如获得p40Cys28与Cys68二硫键的肽段TCHKGGEVL时正是通过Chymotrypsin对肽段前后的Tyr（Y）和Leu（L）的羧采用不同的蛋白酶多酶解增加了基端进行酶解获得，
酶解位点，从而提高了酶解的效果，多酶解的方式比单一酶解方式提高了覆盖率到90%左右，并通过串联质谱技术，对找到的二硫键链接的肽段进行二级质谱分析，显著提高了结果的可信度。采用此方法测定了rhIL-12二硫键配对方式，12样品通过检测确定了rhIL-中存在和理论配对方式相符的7对二硫键（p35分子内cys88未能找到）分别是：p35分子内二硫二硫键cys15-cys174，cys63-cys101。p40分子内二硫键：键：cys42-cys28-cys68，cys109-cys120，cys148-cys171，cys278-cys305。以及分子间二硫键p35的cys74和p40的cys177。
（YYSSSWSEWASVPCS）相符合的MS2图谱。综上所12的鉴定的C端氨基酸序列为：述，对供试品rhIL-P35：VMSYLNASP40：YYSSSWSEWASVPCS，与理论序列完全符合。
3讨论
二硫键广泛存在于原核和真核生物的激素，酶，免疫球蛋白、血浆、抑制剂和毒液等蛋白中，是一种常见的蛋白质翻译后修饰。二硫键作为共价键交联多肽链内或链间的两个半胱氨酸，对稳定蛋白质的空间结构、维持正确的折叠构象、保持和调节其生物活性等都有着举足轻重的作用。因此确定蛋白质一级结构有着重要的意义。分析多肽、蛋白质、抗体药物中二硫键的位置是CFDA对于药物申报的对于药物结构分析要求检定的项目。早起的二硫键配对方式，是通过HPLC肽谱比较还原性与非还原性酶解后的肽段混合物，找出并收集差异峰，通过氨基酸组成分析或N端测序来确定肽段序列，并推测二硫键的配对方式。该方法过程繁
rhIL-12是CHO细胞表达的异二聚体糖蛋白，对重
通过建立酶解结合二级质谱鉴定的方法，证明了12的二硫键位点、C端氨基酸序列基因工程新药rhIL-和糖基化位点与理论一致。本方法具有快速，灵敏，可信度高的特点。
组糖蛋白理化性质特征的分析是保证产品质量的重要方面。一般发生N-糖基化位点修饰的蛋白，都有基本的氨基酸结构骨架为：天冬酰胺X丝氨酸（NXS）或天冬酰胺X苏氨酸（NXT）的结构。用蛋白酶酶解蛋白，再用PNGaseF糖苷酶切除链接在天冬酰胺（ASN）上的糖链，在水中会使ASN转化成天冬氨酸（ASP），分子
18
量增加0．9840Da。在O水中会使ASN分子量增加
参考文献
［1］ChristinaYoon，StevenC．Johnston，etal．Chargedresidues
dominateauniqueinterlockingtopographyintheheterodimericcytokineinterleukin-12．TheEMBOJournal，2000，19（14）：3530-3541．
［2］DelVecchioM，BajettaE，CanovaS，etal．Interleukin-12：
biologicalpropertiesandclinicalapplication．ClinCancerＲes，2007，13（16）：4677-4685．
［3］MajumdarMK，ThiedeMA，MoscaJD，elal．Phenotypicand
functionalcomparisonofculturesofmarrowderivedmesenchymalstemcells（MSCs）andstromalcells．JCellPhysiol，I998，176：57-66．
［4］TingchaoChen．IL-12Facilitatesboththerecoveryofendogenous
hematopoiesisandtheengraftmentofstemcellsafterionizingradiation．ExperimentalHematology，2007，35：203–213．［5］LenaABasile．
Multilineagehematopoieticrecoverywith
2．9890Da。通过检测脱糖后糖肽段分子量变化，从而确定该蛋白质糖基化的位点。通过此原理结合二级质12含有3个N糖基化修饰位点，确定了rhIL-谱分析，
分别为p35亚基的71位和85位以及p40亚基的200位，从而对产品质量研究和质量控制起到重要作用。
使用质谱方法对蛋白质多肽药物分子的C端进行需要满足几个条件。首先，由于质谱方法依赖于分析，
算法对MS图谱进行解析，需要提供蛋白质多肽的理以便用来对算法查库。从现有质谱技论C末端序列，
术来看，从头测序技术（denovo）尚未完善，在相当长的时间内质谱法C端序列分析仍然需要提供蛋白质理论序列。其次，这类质谱方法分析的是酶解后的多肽分子，而不是像Edman方法那样直接分析蛋白质分子。这里的原因是，现在质谱的分析能力集中在800-4000Da范围内。在这个范围内，质谱仪能够有效的分
2
析多肽分子的分子量，并将其破碎后成为MS。因此，
2
concomitantantitumoreffectsusinglowdoseInterleukin-12inmyelosuppressedtumor-bearingmice．JournalofTranslationalMedicine，2008：6-26．
［6］GonzalezJ，TakaoT，etal．AmethodfordeterminationofN-glycosylationdissociation
sitesanalysis
inin
glycoproteinsfast
atom
by
collision-induced
mass
对于大多数蛋白质多肽类的药物分子，都需要在酶解再进行质谱分析。在大多数的酶解成为多肽分子后，
试验中，常用的蛋白质内切酶有胰蛋白酶、胰凝乳蛋白Arg-C酶、Lys-C酶和Glu-C酶等等。不同的蛋白质酶、
内切酶作用于不同的氨基酸残基末端，形成不同长度的C端多肽分子。一般会采用多种酶解联合使用的策略，以期提高质谱仪对C端序列分析的成功率。最后，由于多数蛋白质类药物分子量很多，使用蛋白质内切酶进行酶解后产生大量种类的多肽碎片。一般情况下，需要利用LCMSMS设备的复杂样品的强大分析能力对酶解后的样品解析并寻找C端序列分子，而不能TOF/TOF这类的质谱仪直接分析。使用诸如MALDI-12样品使用Trypsin、Chymotrypsin和本研究对rhIL-Glu-C分别对样品进行酶解，三种酶作用于不同的氨基提高了C端序列分析的成功率，最终在酸残基末端，
Trypsin酶解肽段中分析得到了与rhIL-12C端相对应12两个亚基的的序列，通过此种方法分别确认的rhIL-C端序列与理论序列完全符合。
bombardment
spectrometry：identificationofthepositionsofcarbohydratelinkedasparagineinrecombinantalpha-amylasebytreatmentwithpeptide-N-glycosidaseFin1992，205（1）：151-158．
［7］KusterB，MannM．18O-labelingofN-glycosylationsitesto
improvetheidentificationofgel-separatedglycoproteinsusingpeptidemassmappinganddatabasesearching．Anal．Chem，1999，71（7）：1431-1440．
［8］KristiansenTZ，BunkenborgJ，etal．Aproteomicanalysisof
humanbile．Mol．Cell．Proteomics，2004，3（7）：715-728．［9］KajiH，SaitoH，etal．Lectinaffinitycapture，isotope-coded
taggingandmassspectrometrytoidentifyN-linkedglycoproteins．Nat．Biotechnol，2003，21（6）：667-672．
［10］PerHagglund，ＲuneMatthiesen，etal．Anenzymatic
deglycosylationschemeenablingidentificationofcorefucosylatedN-GlycansandO-GlycosylationSiteMappingofHumanPlasmaProteins．JournalofProteomeＲesearch，2007，6：3021-3031．［11］AnthonyＲ，Mire-Sluis，ＲobinT．Cytokine，london：Academic
press，1998．
18
Olabeledwater．Anal．Biochem，