抗体制备的新技术

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医学综述2007年1月第13卷第1期 Medical Recapitulate, J an 2007, Vol. 13, No. 1

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抗体制备的新技术

莫发荣(综述) , 谢小薰, 罗国容(审校)

(广西医科大学组织学与胚胎学教研室, 南宁530021)

中图分类号:R392. 11 文献标识码:A 文章编号:1006 2084(2007) 01 0004 02

摘要:抗体的研究已有100多年的历史, 其制备技术经历了血清多克隆抗体、鼠源单克隆抗体和基因工程抗体三个时期。本文就基因工程抗体制备的新技术简要综述。

关键词:抗体制备; 新技术; 噬菌体; 基因表达

New Techniqu e of Antibody Preparation M O Fa rong , XIE Xiao xun , L U O Guo rong . (De part

ment o f Histology and Embryology , Guangxi Me dical U nive rsity , Nanning 530021, China )

Abstract :The study of antibody had been carri ed out more than 100years ago. The technique of antibody preparation has gone through three periods i ncludi ng pol yclonal anti body, monocl onal antibody from mous e and gene tic engineering antibody. This article revie wed the new technique of antibody prep arati on from genetic engineeri ng.

Key words :Anti body preparati on; New technique; Bacteriophage; Gene expres sion

1 人鼠嵌合和转基因技术

应用DNA 重组技术将小鼠抗体基因上的可变区与人抗体基因的恒定区重组, 再将重组后的基因导入骨髓瘤细胞中表达, 使可变区人源化, 获得人鼠嵌合抗体。通过携带部分人抗体可变区基因位点的转基因小鼠, 利用杂交瘤技术获得人源化抗体[4, 5]。其方法是将人的轻、重链基因通过脂质体导入或原生质体融合入小鼠胚胎干

多克隆抗体是研究和应用最早的抗体, 其制备方法简便而且经济, 一般流程为:以纯化的抗原和佐剂乳化后免疫动物

获得免疫血清并加以纯化。但由于其针对多个表位, 特异性较低, 故在临床上主要用于一般的抗原检测而对临床诊断和治疗没有多大价值。1975年Kohler 等[1]用杂交瘤技术制备单克隆抗体, 其基本程序为:将抗原免疫小鼠, 过量免疫的供体中获取脾细胞, 再与带有遗传标记并已适应于组织培养的骨髓瘤细胞融合, 然后测定杂交细胞混合群体分泌抗体的能力, 最后对单个细胞进行克隆建株。单抗与抗原的结合比多抗具有更高的特异性且重复性好, 在基础研究、临床诊断及治疗、免疫预防等领域发挥了重要作用。但该技术制备的单抗也具有很多缺点:鼠源单抗可诱发人抗鼠抗体(HAMA) 的生成[2], 其免疫原性限制了它在人体内的应用; 不能有效地激活补体和Fc(免疫球蛋白Fc 段) 受体相关的效应系统, 且生物半衰期很短[3]; 抗体分子大而难以穿透肿瘤毛细血管降低了其靶向特异性; 难以获得稀有抗体; 抗原用量大, 免疫程序长, 价格昂贵, 难以大量生产。随着分子生物学和分子免疫学的发展, 通过改进制备方法, 获得了基因工程抗体。基因工程抗体是应用基因工程技术将目的抗体基因重组并克隆到表达载体中, 在适当的宿主中表达并折叠成有功能的抗体分子。基因工程抗体在很大程度上克服了传统单克隆抗体的缺点, 大大拓宽了抗体的应用范围。目前研制的基因工程抗体主要是嵌合抗体、人源化抗体、Fab 抗体、Fv 抗体和单链抗体(ScFv) 等。

细胞, 获得含目的抗体的轻链和重链的小鼠后, 与内源性轻、重链双缺失的小鼠杂交, 可筛选到能产生目的抗体的小鼠。

人鼠嵌合抗体和人源化抗体有效地克服了HAMA 的缺陷, 占据了目前治疗性抗体的商品市场, 截止到2004年美国FDA 批准生产的17个治疗性抗体中有12个是人鼠嵌合或人源化抗体(表1) [6]。

2 展示技术

展示技术为获得抗体提供了强有力的工具, 它既保存了天然抗体谱, 又能通过DNA 重组建立抗体库筛选出新奇的分子。可分为以细胞为基础系统的噬菌体展示技术和细胞表面展示技术, 以及无细胞系统的核糖体展示技术和mRNA 展示技术。

2. 1 噬菌体展示技术 1990年McCafferty 等[7]报道了用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体的方法, 此后得到了广泛的应用。噬菌体展示技术是一种基因表达产物和亲和筛选相结合的技术, 以改构的噬菌体为载体, 把待选基因片段定向插入噬菌体外壳蛋白质基因区, 使外源多肽或蛋白质表达并展示于噬菌体表面, 进而通过亲和富集法筛选出有特异肽或蛋白质的噬菌体[8]。其建立基于三个原因: 在p 和p ! 衣壳蛋白的N 端插入外源基因, 形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面, 不影响和干扰噬菌体的生活周期, 同时保持的外源基因天然构象, 也能被相应的抗体或受体所识别; ∀利用固定与固相支持物的靶分子, 采用适当的淘洗(panning) 方法, 洗去非特异结合的噬菌体, 筛选出目的噬菌体; #外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面, 而其编码基因作为病毒基因组中的的单链导出 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39960022; 30160024;

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菌体抗体库技术模拟了机体免疫系统的选择作用, 利用噬菌体载体构建抗体文库, 通过己知抗原筛选特异的高亲和性抗体[9]。该技术实现了基因型和表现型的转换。利用噬菌体展示技术筛选出的多肽, 特异性高、容易保存而且可大量制备, 避免了常规抗体制备周期长、特异性不高、纯化复杂等缺陷。2. 2 细胞表面展示技术 细胞表面展示技术包括细菌细胞表面展示技术和酵母表面展示技术, 它和噬菌体展示技术都依赖细胞技术和体内基因的表达。但二者也有不同, 噬菌体展示是将表达的重组蛋白或多肽融合到噬菌体外壳蛋白区, 细胞表面展示是将表达的重组蛋白与筛选信号直接合并到细胞表面[10]。10年前首例报道了在革兰阳性菌上的表面展示技术, 此后被广泛应用于免疫学、微生物学和生物工程学。

[11]

Feldhaus 等用流式细胞计量术从无免疫性的酿酒酵母表面展示库中分离出人单链抗体SC FV 片段。Fab 抗体片段亦能展示在酿酒酵母表面, Blaise 等[12]用酵母杂交构建了多样化的酵母细胞表面展示库并应用于制备高亲和力的Fab 抗体片段。

2. 3 核糖体展示和mRNA 展示技术 核糖体展示和mRNA 展示技术被认为是下一代在体外生成抗体的展示技术, 它是一种不依赖细胞系统的离体筛选蛋白质和多肽的方法, 它的基本原理是将表现型的蛋白质与基因型的mRNA 耦联生成稳定的蛋白质 核糖体 mRNA 复合物或蛋白质 mRNA 二元复合物, 并利用mRNA 的可复制性, 使靶基因(蛋白) 得到有效富集的一项技术。核糖体展示和mRNA 展示技术筛选抗体的整个过程都在体外进行, 不受细菌转化的限制, 能产生更大容量的库。另外, 由于mRNA 链和其所编码的蛋白质共价连接, 可以在严格的选择条件下筛选突变体, 去除更多的对照, 准确地筛选出有意义的突变体。因此具有比以细胞为基础系统的噬菌体展示技术和细胞表面展示技术更多的优点。它适用于外源性中毒、蛋白水解敏感和不稳定的蛋白, 并允许在确定位点上合并被修饰过的氨基酸。结合PCR 技术, 通过突变和淘汰的反复循环, 导致连续的DNA 多样化和蛋白质淘汰, 获得改良功能的抗体。通过一种或多种原核和真核细胞表达系统还可以获得衍生的抗体, 从而得到更大的抗体库[13 16]。

表1 截止2004年美国FDA 批准上市的治疗性抗体

名 称OKT3Reopro Panorex Ri tuxan Zanapax Re micade Synagi s Simulect Hercepti n Myl otarg Campath Zevalin X olair Humi ra Bexxar Erbitux Avas tin

靶向抗原

CD 3

血小板受体%b a 17 1A CD 20CD 25TNF RSV CD 25HER2 neu CD 33CD 52CD 20IgE Fc TNF CD 20EG FR VEGF

适应证

移植排斥冠心病大肠癌淋巴瘤移植排斥

炎症性肠病、类风湿RSV 感染移植排斥乳腺癌

急性髓系白血病

慢性淋巴细胞白血病淋巴瘤过敏症类风湿淋巴瘤

晚期直肠癌结直肠癌

抗体种类

鼠mAb

人 鼠嵌合Fab 鼠mAb

人 鼠嵌合IgG1人源化抗体人 鼠嵌合IgG1人源化抗体人 鼠嵌合IgG1人源化抗体

人源化抗体 化疗药物交联物人源化抗体鼠IgG1 放射性核素共轭化合物人源化抗体人IgG1鼠mAb

人 鼠嵌合IgG1人源化抗体

公 司

J ohns on Centor Lill y Centocor IDEC Genentech Roche Roche Centocor MedImmune Novartis Genentech Wyeth Ayers t M illenium

DEC Pharmaceuticals Tanox Genentech Novartis Abbot CAT Corixa Imcl one Genentech

批准时间19861994

1995(德国) [1**********]8、[***********][***********][1**********]4

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收稿日期:2006 06 18 修回日期:2006 12 07