毒蕈碱乙酰胆碱受体新成员_孤儿受体m_5

毒蕈碱乙酰胆碱受体新成员:孤儿受体

王 昊 陆 阳 陈红专(上海第二医科大学药物研究所,上海200025)

*m5

摘要 m5受体是M受体家族一个新成员,与其它亚型相比,由于缺乏高选择性配体和标记条件以及富含m5受体的组织来源,目前对其分子结构、结合特性、组织分布、生理功能等知之甚少。随着免疫沉淀、原位杂交和药理学标记方法的发展,现已证实m5受体主要分布于大脑皮质最外层,海马齿状回、CA1、CA2区,嗅结节,横核以及外周血淋巴细胞、单核细胞、睫状肌等部位,提示m5受体在调节大脑和外周组织胆碱能神经活动方面具有独特而重要的作用,有可能成为治疗帕金森病、阿尔采末病、局灶性脑缺血等疾病新的药物靶点。关键词 M受体;m5受体;孤儿受体学科分类号R96

毒蕈碱乙酰胆碱受体(muscarinicacetylcholinereceptor,mAChR),即M受体,是G蛋白偶联受体(Gprotein-coupledreceptor,GPCR)超家族中的一员,在中枢神经系统,参与运动控制,体温、血压调节和学习、记忆等过程;在外周组织,调节平滑肌收缩、腺体分泌及心率和心肌收缩力等功能。因此,深入研究M受体及其亚型的结构和功能,开发其高选择性的激动剂或拮抗剂对于治疗阿尔采末病、帕金森病、哮喘、心肌及胃肠道平滑肌功能紊乱等疾患大有裨益。

分子生物学上,M受体分五个亚型:m1~m5,相应的药理学分型为M1~M4,m5为孤儿受体。受体蛋白七次跨过细胞膜,形成七个跨膜区(TM1~7),三个胞外环(O1~3),三个胞内环(i1~3),N末端在细胞外,C末端在细胞内。七个跨膜区以TM3为中心逆时针轮辐状排列,中心疏水性凹陷为配体结合部位。五个亚型间氨基酸序列同源性较高,尤其是七个跨膜区,而i2和i3环变异较大。一般情况下,M1、M3、M5亚型与Gq/11A偶联,激活磷酯酶C,水解磷酸肌醇二磷酸(PIP2)为二酯酰甘油(DG)和肌醇三磷酸(IP3);M2、M4亚型与GiA和GoA偶联,抑制腺苷酸环化酶,减少cAMP的生成。

从哺乳动物脑中克隆M1~M4受体后不久,第五种M受体亚型m5即被克隆(Bonner.1988)。此后,逐渐对m5受体分子结构,配体结合,组织分布,生理功能等特点才有了一定认识。

一、m5受体的分子生物学

人m5受体蛋白由532个氨基酸组成,长度仅次于M3(590个氨基酸),长于M1(460个氨基酸)、M2(M(,[1]

于15号染色体长臂2区6带(15q26),由2149个碱基构成,只有一个外显子,无内含子。m5与M3受体

在结构上最为相似,同样具有较大的i3环;人与大鼠m5受体(531个氨基酸)有89%的同源序列,差异主要发生在i3环(80%同源),因此i3环决定不同M受体亚型间以及不同种属相同受体间序列的差异。

m5受体具有GPCR特征性的结构,七次跨过细胞膜,细胞外侧的N末端有两个糖基化位点,但这种化学修饰并非受体表达和发挥功能必须;分子内部有19个保守的氨基酸残基,其中4个脯氨酸分别位于TM4、TM5、TM6、TM7区,使跨膜A螺旋在该处形成30b折角;两个保守的半胱氨酸残基分别位于O1和O2环,相连形成二硫键以维持受体蛋白稳定的分子构象;C末端在细胞内,其上的棕榈酰化发生在近胞膜处的半胱氨酸残基上,棕榈酸的另一端与胞膜相连,形成第4胞内环(i4),增强受体与G蛋白的偶TM6与M受体的基础活性和与激动剂的亲和力。Spalding等用不同氨基酸替代该区域内S465,发现大分子量或碱性氨基酸使受体基础活性增加至carbacol在野生受体上最大效应(Rmax)的55%和110%,并伴随着carbacol结合能力和作用效能的提高,其它氨基酸替代作用中等或不明显,反向拮抗剂atropine可以翻转所有突变受体升高的基础活性,提示S465突变选择性地使m5受体失活状态失稳定,有利于受体在无激动剂作用的情况下进入活化状态,说明S465是m5受体活*

[2][3]

国家自然科学基金资助课题(30070860)

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M受体i3环是G蛋白偶联的关键部位,尤其是临近细胞膜的N末端(Ni3)和C末端(Ci3)。m5受体Ni3内I216、Y217、T220、R223,以及Ci3内K439、A440、A441是m5受体与G蛋白偶联的重要残基。这些重要的氨基酸残基在空间位置上彼此靠近,共同形成了一个G蛋白结合的部位,其中I216、T220和A440在局部形成一个与G蛋白结合的疏水性/口袋0,K439和R223位于边缘,与G蛋白形成高亲和性离子键结合。由于TM6在受体活化过程中发生构象变化,故K439将引导G蛋白到受体介导的活性反应中来。另外,Y217亦直接参与G蛋白偶联作用,A441则影响m5受体与G蛋白的亲和性。因此m5受体i3环的Ni3和Ci3在局部形成一个由疏水性核心和带正电/盖子0组成的G蛋白结合/口袋0。

i2环不决定M受体与G蛋白作用的特异性,却可以控制二者偶联的强度。m5受体i2环内存在两组作用不同的氨基酸残基,一组为受体与G蛋白脱偶联的失活状态必须,另一组为受体与G蛋白偶联的活化状态必须。它们定位于A螺旋相对的两个平面上,平面间夹角约100b,提示m5受体通过i2环内两组不同的氨基酸残基阻碍或促进G蛋白偶联。

二、m5受体的药理学特性及其意义

迄今,m5受体亚型特异性的配体和标记条件仍未获得。Watson等

[4]

受体仍不易检测。为进一步减少干扰,Flynn等[5]探索应用绿色窄头眼镜蛇毒液(greenmambavenom)选择性地标记m5受体,在这种蛇毒浓度为30Lg/ml时,[3H]NMS可以标记几乎全部的m5受体和不足10%的M4受体,无M1~M3受体;联合应用蛇毒和AQ-RA741,可标记55%的m5受体和12%的M3受体,M1、M2、M4受体完全被排除。由于脑组织中m5与M3受体的表达水平基本相当,两者4÷1的标记比例使标记结果主要代表m5受体。近来,Miyoshi等[6]从大响尾蛇(crotalusatrox)毒液中提纯了一种M受体拮抗剂,可抑制[3H]QNB和[3H]NMS与所有M受体亚型的结合,并在m5受体表现最大的拮抗效应,有望成为新的m5受体亚型特异性工具药。

作为孤儿受体,m5受体为新药筛选提供有效的靶点。孤儿受体(orphanreceptor)是指其编码基因与某一受体超家族成员有同源性,但目前在体内还没有发现其配体。开发以孤儿受体为靶点的药物可应

用逆向分子药理学(reversemolecularpharmacology)方法建立新药筛选模型,即将克隆的孤儿受体基因在哺乳动物细胞中表达,此配体为标记物筛选该受体的激动剂和拮抗剂,研究它们的生物学及药理学效应,进而阐明孤儿受体的功能,最后应用该受体筛选治疗某种疾病的特效药。

三、m5受体的组织分布及其生理功能

m5受体解剖学定位的研究曾长期受阻于缺乏特异性的配体、毒素和抗体。近来,免疫沉淀的结果显示脑内纹状体、海马、间脑、脑桥和小脑等部位存在m5受体低水平的表达(

受体确定拮抗剂亲和常数的排序是atropine(8.7)

\tolterodine(8.6)=4-diphenylacetoxy-N-methylpiperidine(4-DAMP,8.6)>darifenacin(7.7)\zamifenacin(7.6)>oxybutynin(6.6)=para-fluo-rohexahydrosiladifenidol(p-F-HHSiD,6.6)>piren-zepine(6.4)\methoctramine(6.3)=himbacine(6.3)>AQ-RA741(6.1)。无拮抗剂表现出对m5受体高于对M3受体的选择性,其中himbacine、AQ-RA741、p-F-HHSiD、darifenacin和oxybutynin对M3的亲和力高于m5受体650倍,提示M3与m5受体间药理学特征的相似性,并确定这五种拮抗剂可用来区分M3与m5受体。

AQ-RA741和AF-DX384与m5受体的亲和力仅为M1~M4受体的10%,提示这两种化合物在排除大多数M1~M4受体浓度时,大部分m5受体被保留,可用非选择性放射性配体标记。例如1Lmol/LAQ-RA741存在时,[3H]NMS可以标记约60%的m5受体和20%或更少的M1~M4受体。但由于脑组织中m5M

#158#生理科学进展2003年第34卷第2期

式与传统机制不同,m5受体兴奋不能引发磷酸肌醇的释放,却可以产生花生四烯酸,并抑制cAMP积聚。

用6-羟多巴胺使大鼠黑质和腹侧被盖区多巴胺能神经元变性后,m5受体结合及其mRNA消失,提示m5受体是多巴胺能神经元上唯一的一种M受体,介导乙酰胆碱对该神经元的兴奋作用。多巴胺释放分三个时相:第一相,快释放相,在电刺激后约2min时,可被烟碱和谷氨酸抑制;第二相,释放抑制相,在38min时,多巴胺释放减少,可被scopolamine和methoctramine阻断,提示抑制性M2受体起关键作用;第三相,慢释放相,持续在1060min之间,被scopolamine抑制。m5突变大鼠大脑腹侧被盖区内多巴胺释放显现正常的第一相,延长的第二相,缺少第三相,说明多巴胺的慢释放相完全依赖于m5受体

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这个神秘而/棘手0受体的研究热情和信心。相信,随着m5受体特异性配体和抗体以及表达人m5受体组织和细胞的应用,m5受体结构和生物学功能的奥秘将逐步被揭开,以m5受体为靶点的药物将在神经退行性疾病等治疗中发掘其应用前景。

参

考

文

献

1 CaulfieldMP,BirdsallNJM.Internationalunionofpharmacolo-gy.Ú×.Classificationofmuscarinicacetylcholinereceptors.PharmacolRev,1998,50÷279290.

2 FordDJ,EssexA,SpaldingTA,etal.Homologousmutationsnearthejunctionofthesixthtransmembranedomainandthethirdextracellularloopleadtoconstitutiveactivityandenhancedagonistaffinityatallmuscarinicreceptorsubtypes.JPharmacolExpTher,2002,300÷810817.

3 SpaldingTA,BursteinES,WellsJW,etal.Constitutiveact-ivationofthem5muscarinicreceptorbyaseriesofmutationsattheextracellularendoftransmembrane6.Biochem,1997,36÷1010910116.

4 WatsonN,DanielsDV,FordAPDW,etal.Comparativephar-macologyofrecombinanthumanM3andM5muscarinicreceptorexpressedinCHO-K1cells.BrJPharmacol,1999,127÷590-596.

5 ReeverCM,Ferrar-iDiLeoG,FlynnDD.TheM5(m5)receptorsubtype:factorfiction?LifeSci,1997,60(13-14)÷11051112.6 MiyoshiS,TuAT.Asnakevenominhibitortomuscarinic

acetylcholinereceptor(mAChR):isolationandinteractionwithclonedhumanmAChR.377÷290295.

ArchBiochemBiophys,

2000,

。此外,m5突变大鼠亦出现pilocarpine(1mg/

ml)刺激的唾液分泌量的轻度降低,在给药后1560min时,说明虽然唾液腺分泌主要由m5以外的其它受体控制,但m5受体参与慢分泌相。依赖于m5受

体的多巴胺慢释放相和唾液腺慢分泌相在时程上很相似,提示m5受体在脑内缓慢性神经活动中的重要作用。在涉及多巴胺能神经元的慢性疾病如帕金森病、精神分裂症等中m5受体的作用,将使其选择性药物的研制和开发更具应用价值。另外,m5突变大鼠的饮水量是正常大鼠的2倍,摄食量仅轻微降低,且饮水量不受食物干燥或湿润的影响,提示剧渴不是由代谢因素和口腔干燥引起,说明m5受体参与摄水过程。

Yamada等在m5基因敲除小鼠(m5R)身上发现一个惊人的现象:高效的血管扩张剂乙酰胆碱,在m5R-/-[9]

-/-

7 KohnEC,AlessandroR,ProbstJ,etal.Identificationand

molecularcharacterizationofam5muscarinicreceptorinA2058humanmelanomacells,couplingtoinhibitionofadenylylcy-claseandstimulationofphospholipaseA2.JBiolChem,1996,271÷1747617484.

8 ForsterGL,YeomansJS,TakeuchiJ,etal.M5muscarinicre-ceptorsarerequiredforprolongedaccumbaldopaminereleaseaf-terelectricalstimulationoftheponsinmice.JNeurosci,2002,22÷16.

9 YamadaM,LampingKG,DuttaroyA,etal.Cholinergicdila-tionofcerebralbloodvesselsisabolishedinM5muscarinicacetylcholinereceptorknockoutmice.ProcNatlAcadSciUSA,2001,98÷1409614101.

10 ElhusseinyA,HamelE.Muscarinic-butnotnicotinic-acety-l

cholinereceptorsmediateanitricoxide-dependentdilationinbraincorticalarterioles:apossiblerolefortheM5receptorsubtype.JCerebBloodFlowMetab,2000,20÷298305.

小鼠身上失去了扩张脑动脉血管的

能力,但扩张脑外动脉的能力不受影响。可以设想血管内皮细胞上m5受体活化是胆碱能神经松弛脑

血管的第一步,之后,m5受体与Gq蛋白偶联,使细胞内IP3水平升高,内源性Ca释放,激活内皮细胞内NO合酶,生成NO,继而扩张动脉血管,增加局部脑组织血流量。胆碱能神经扩张脑血管床功能受损可能在阿尔采末病和局灶性脑缺血中发挥作用,故此脑血管上m5受体代表一个极有潜力的药物靶点。

四、结语

总之,以上所述研究成果仅是认识m5受体之路上迈出的一小步,将其综述于此是为了激起人们对

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