生物技术进展
生物技术进展
氧化还原电位在微氧厌氧发酵中的控制和应用
摘要
许多发酵产物是在微氧或厌氧条件下产生的,这样的条件下溶解氧探头检测不到氧气,这就为发酵过程的监控和控制提出了一个挑战。胞外氧化还原电位影响细胞内的氧化还原平衡和新陈代谢,易被检测,这就为检测和控制发酵产物的发酵过程提供了另一种替代选择。本文回顾了氧化还原电位在影响基因表达,蛋白质合成和代谢方面的最新进展,以及如何通过控制ORP获得更有效的发酵产物,比如在微氧条件下使酵母菌进行乙醇型发酵和在厌氧条件下使梭状芽孢杆菌进行以丁醇为主要产物的发酵。
1综述
自人类的祖先开始制作泡菜、酸奶、米酒等食品和饮料以来,发酵有着一个悠久的历史。为了追求理想的风味许多发酵是在微氧和厌氧条件下进行的,同时要进行污染控制因为大多数有害微生物在有氧条件下迅速传播。最近,在原油的可持续供给和石油基础产品特别是运输燃料过度消费给生态环境带来的影响受到关注,微氧和厌氧发酵条件下产生的生物燃料乙醇和丁醇也受到了全世界的关注。
不同于有氧培养和溶解氧可以在线监测的发酵,微氧和厌氧发酵的一大挑战是缺乏实时过程监控技术,因为常常发酵过程中的PH值监测仅仅反映了质子活性,因此对细胞内代谢的微妙变化它是不灵敏的。氧化还原电位,氧化还原或(ORP),反映整体的电子转移和在细胞内的代谢中涉及的氧化还原平衡,一个世纪前两个剑桥大学的教授便预测到了它的意义。虽然在相对简单的化学反应系统中已经确立了ORP原理和测量,但是ORP对生物系统中的核心细胞代谢的影响和生物工程中ORP控制的应用仍是十分有限的。
目前,为了深入理解细胞内的氧化还原平衡和细胞生理和代谢之间的影响,研发出可以穿透单个细胞的纳米传感器,能直接测量细胞内氧化还原电位,这为具有氧化还原途径偏好的工程菌进行理想发酵获得期望的发酵产物提供了依据。另一方面,通过反映细胞内的氧化还原电位同步电极便可以容易检测到胞外的氧化还原电位,因此,如图1所示,通过改变细胞内ORP和代谢模式可以实现OPR控制策略。
在这篇文章中,回顾了ORP对细胞内代谢影响的最新进展,以微氧条件下酵母酿酒中乙醇发酵和厌氧条件下梭状芽孢杆菌产丁醇作为例子,从分子水平和工艺过程两个方面讨论了获得高效发酵产物的ORP控制策略。
2 ORP对代谢的影响
2.1ORP原理
ORP表示化合物获得电子的趋势。因此,一个氧化还原反应中需要两种化合物,反应中还原性化合物将电子提供给氧化性化合物,每个氧化还原对有其内在OPR值。电子亲和力越强,氧化还原对的氧化还原电位就越高。表一概括了细胞内新陈代谢中主要氧化还原对的标准ORP值。不同于原电池半反应,无论是好氧抗生素发酵、微氧或厌氧条件下乙醇丁醇发酵,氧化还原反应都是在细胞内同时发生的。使得细胞外OPR监测可以作为细胞内电子传递和氧化还原平衡代谢净结果的一个指标。
相对于提供质子信息的PH值,ORP则表示了电子的活动。因此ORP对细胞内的微妙变化更为灵敏。ORP电极系统包括由铂、铑、铱和金等惰性金属构成的检测电极和由Ag和AgCl组成的参比电极组成,可以实时监测发酵系统的氧化还原信息,这种电极对细胞内代谢的影响可以忽略不计。
2.2环境因素对ORP的影响
一般情况下,温度和氧化性还原性化合物的比例对调节溶液中氧化还原电位是很关键的。
对于培养和发酵中的生物应该考虑溶解氧和厌氧条件等环境因素。但在用酵母产乙醇的微氧发酵中,溶解氧探头无法检测到溶解在发酵液中的痕量溶解氧。如表一所示,O2/H2O的标准氧化还原电位是细胞代谢所有氧化还原对中最高的。因此,如果电子转移,即使溶氧量远低于其他代谢产物,氧必须是优先受体,进而更加有效影响ORP。至于厌氧发酵,由于没有溶解氧和化学物质不同程度的减少,补充培养基营养底物和释放到发酵液中的代谢产物的影响变得至关重要。
2.3细胞内氧化还原电位的动态平衡
共轭氧化还原对和他们的动态平衡是进行细胞内代谢的基础,ORP通过基因表达和酶的合成影响生物细胞的功能,从而影响到信号的感应和传导,最终影响代谢类型,特别是在工业生产相关的应力条件下。
由于检测细胞内ORP的技术限制,常用细胞质中的氧化还原对来表征ORP状态。在不同氧化还原对中,氧化型NAD+和NADP+是两个主要的辅助因子,它们从其他分子接受电子形成NADH和NADPH,NADH/ NAD+和NADPH/ NADP+这两个氧化还原对分别主导了细胞内的新陈代谢。例如,2012年10月以带有NAD+和NADP+作为辅助因子的106和88酶催化了包括855和1064的生物信息数据库KEEG中的氧化还原反应。因此,细胞内的氧化还原电位主要取决于NADH/NAD+的比率,较少取决于NADPH/NADP+的比率。
3 ORP控制策略
发酵系统中氧化性还原性物质的比率决定了氧化还原电位。因此调节ORP的策略主要集中在如何改变氧化还原性物质的比率,已经探索出的策略包括代谢工程和工艺工程技术中的菌株改进。表2总结了一些ORP控制条件下产生的代谢产物。
3.1菌株改造
理论上,通过改变体内电子转移和氧化还原反应中关键酶编码基因的表达,在分子水平上可以控制ORP。这个方法主要通过大肠杆菌和酿酒酵母这两种模式生物来实现。在大肠杆菌中去除pflB和adhE可以增加NADH含量,以致乳酸积累。Berríos-Rivera et al. (2002)使大肠杆菌中甲酸脱氢酶过度表达,以致NADH/ NAD+的比率增加,进而降低ORP水平。Singh et al. (2009)研究了去除带有丙酮酸甲酸裂解酶基因和乳酸脱氢酶的大肠杆菌菌株会导致ORP不平衡。Hou et al研究了不进行甲酸代谢的酿酒酵母菌的细胞质或者线粒体中依赖于NAD+的甲酸脱氢酶的相似的基因,结果表明可以调节细胞各组分在甲酸氧化过程中的NADH。虽然针对的仅仅是代谢网络中一个或几个关键酶,但是会影响细胞内ORP的应用功能。
3.2工程工艺技术
虽然通过代谢工程工具开发具有较好氧化还原途径的健壮菌株,是解决高效生产各种发酵产物的最终方案,由于生物系统中固有的复杂性,这方面的进展费时缓慢,成功的例子也很有限。相比之下,工程工艺技术可以给工业生产中技术经济产能带来立竿见影的效果。
3.2.1能量输入
通过有电流形式的能量输入提供的电流,带有电极的生物电化学反应器可以控制发酵系统中的ORP。生物电化学反应器的功效依赖于微生物和工作电极表面之间的相互作用,但反应机制有待阐明。因此,工作电极的电位和发生在电极表面非生物反应电位是两个关键因素。 不同的微生物系统都已探索出这样的电化学ORP控制策略,像运动发酵单胞菌纯培养发酵 (Jeon etal., 2009a)酿酒酵母发酵(Na et al., 2007),丙酮丁醇梭菌产丁醇(Peguin and Soucaille, 1996)等。
3.2.2补充试剂
氧化还原试剂铁氰化钾,甲基紫精和中性红等化学物质不同程度减少,可以作为影响环境ORP和细胞代谢的电子载体补充到发酵系统中(Bagramyan et al., 2000; Girbal
et al., 1995; Peguin and Soucaille,1996)。另一方面,胱氨酸/半胱氨酸,氧化/还原的谷胱甘肽和NADH/ NAD+是主要的生物氧化还原对,它们不仅影响ORP的状态,而且可以直接作为细胞内代谢的中间体。因此,可以补充维生素烟酸这样的氧化还原试剂或者前体。
3.2.3充入气体
向发酵系统中充入氧、氢和一氧化碳这些氧化还原活性气体控制ORP,溶解氧可以提高ORP,氢可以降低ORP。另外,也可以向发酵系统中充入惰性气体氮气和氦气分离溶解氧和氢,从而间接影响ORP。
在酿酒酵母发酵过程中分别充入氧、氢、氦,创造不同的ORP条件,研究其对酵母菌生理和代谢的影响。通过ORP控制可以深入理解如何高效产乙醇。像严格厌氧的梭状芽孢杆菌发酵产丁醇这样的厌氧发酵,一氧化碳抑制氢化,所以氢气产物的充入可直接减少溶剂中物质功耗。相比之下,通入氮气可以分离氢和激活产氢酶,从而提高发酵产氢量。
4 微氧条件下ORP控制:乙醇发酵
乙醇燃料目前是全球范围内商业化生产的一种主要生物燃料,它的主原料是糖和淀粉。比较温度,PH值,培养基成分这些参数,因为与糖酵解途径相关的氧化还原平衡和乙醛产乙醇量的减少,在培养基含糖不超过250g/L和发酵液中乙醇浓度低于13%的发酵条件下,ORP对乙醇发酵影响很小,如图二所示,在抑制乙醇产生条件下,酵母菌有良好的耐受性。 为了显著增加乙醇的滴度,使用含糖超过250g/L的培养基进行VHG发酵,因为大幅减少了放电,不仅节省了乙醇蒸馏时的能量消耗,而且也节省了酒槽处理时的能量消耗 (Bai et al., 2008)。然而,当在VHG条件和严格应力条件下进行乙醇发酵,特别是抑制乙醇浓度升高条件下,会对酵母细胞的生存能力产生不利影响,造成发酵时间的延长和更多未发酵的糖发酵(Ingledew, 1999)。酵母细胞会合成甘油这样的保护性代谢物来应对应力,减损乙醇产物中NADH,导致氧化还原的不平衡,使ORP控制更有效。
4.1VHG乙醇发酵中的ORP分布
如图三所示,酿酒酵母菌中VHG乙醇发酵的ORP分布图类似浴盆(Lin et al., 2010)。当酵母细胞被接种到新鲜培养基中,呼吸作用快速消耗了作为电子受体的溶解氧,使ATP增长,从而ORP大幅降低。随着溶解氧逐步减少,酵母菌代谢从有氧生长切换到厌氧发酵产乙醇,在此期间,为了减少还原当量NAD(P)H的消耗,促使甘油合成的许多途径都被激活。此外,过量的葡糖糖底物,进一步降低了ORP。由于糖的消耗,使得酵母生长和乙醇发酵速度降低,酵母细胞的裂解和相应的氧化代谢产物释放到环境中也使得ORP开始增加。
4.2ORP控制策略
不像丁醇发酵工程已经深入探索到对直接碳通量和高效产丁醇的电子流的菌株改良,酵母菌的发酵产乙醇方面类似的研究却是非常有限的,酵母发酵产乙醇方面的探索主要集中在在糖发酵过程中增加乙醇产量降低甘油产量,和从木质纤维中通过戊糖发酵产乙醇。近日,在VHG发酵条件下,提高酵母生存能力和增加乙醇产量的生物工程策略都得到了改进。
4.2.1菌株改良
在发酵过程中,主要副产物甘油会和乙醇竞争碳通量和能耗,因为甘油的合成需要NADH,而NADH对乙醛还原产乙醇也是必须的。因此,要改善发酵工程策略,像改变菌株内部氧化还原平衡,通过去除过度表达的关键酶基因重新分配碳通量。
Guo et al. (2009) 去除了工业酵母中编码甘油-3 - 磷酸脱氢酶的GPD1或GPD2基因。从而使发酵过程中甘油减少,乙醇得到增加。但是,较低密度的生物量会降低乙醇产率。为了解决去除GDP1和GDP2引起的氧化还原失衡,研究人员从蜡状芽孢杆菌和gpd2
Δ酵母菌株找到了相关的异源基因 (Guo et al.,2011),它们能在减少甘油生成的同时增加乙醇的产量,并且不影响改良菌株的生长。
4.2.2生物工艺工程技术
在乙醇发酵过程中常通过控制曝气量来调节氧化还原电位(Lin et al., 2010; Liu et al., 2011a; Yu et al.,2007),曝气过程中需要一个由ORP探针和控制器组成的反馈系统,一旦ORP值低于设定值就会自动调节曝气时间和速率。观察发现,在VEG发酵条件下,乙醇产量最大产率最高的ORP值是-150mv(Lin et al., 2010; Yuet al., 2007)。此外,Liu et al. (2011a) 还研究了以葡萄糖作补给维持ORP。然而,由于无法维持较高细胞存活率,乙醇产量提高有限。为了解决这个问题,设计一个连续曝气过程刺激酵母细胞的生长,增强他们的生存能力(Liu et al., 2011a)。
5 厌氧条件下ORP控制:丙酮-丁醇-乙醇发酵
严格厌氧菌梭状芽孢杆菌可以产ABE,比例约为3∶6∶1(Jones and Woods, 1986)。相比乙醇,丁醇中能量值较高,且不易挥发,兼容性较高,被视作为一种先进的生物燃料(Dürre, 2008)。然而发酵产丁醇费用高。一方面,乙醇量和丙酮量增加会降低丁醇产量,这就增加了原料消耗。另一方面,由于细胞中丁醇毒性会消耗大量丁醇,所以,丁醇发酵液中滴度极低(Keasling and Chou, 2008)。
5.1产丁醇中ORP的影响
如图4所示,ABE发酵是一个酸化和水解双相反应的过程(Lee et al., 2008),可以通过电子平衡和氧化还原平衡来控制。在生成ATP的产酸过程中生成的乙酸和丁酸,和糖酵解途径中生成的NADH一起合成细胞生长所需物质。随后,由于乙酸酯和丁酸酯的积累,细胞生长减慢,最后停止在固相中,然后水解葡萄糖摄取酸性中间体开始形成溶剂。因为丁醇的毒性,细胞自溶随即发酵结束。因此,在ABE发酵中ORP控制是非常有效的,最近丙酮丁醇梭菌全转录调控甲基紫精发酵中形成的人工电子载体更是说明了这一点(Hönicke et al.,2012),这种ORP控制同样可以运用到ABE发酵前期的水解当中(Wang et al., 2012)。
酸化
在产酸阶段,通过糖酵解途径每消耗一摩尔葡萄糖,会生成两摩尔丙酮酸和ATP、NADH。丙酮酸氧化还原酶
5.2ORP控制策略
控制细胞内的电子传递和氧化还原平衡,可以使梭菌代谢生成更多丁醇。通过菌株改良和生物工程工艺这两种策略可以达到控制效果。
5.2.1菌株改良
与已建立好的大肠杆菌和枯草芽孢杆菌模型不同,梭状芽孢杆菌的代谢工程具有更大的挑战。虽然已经开发了基因改造,基因过度表达,基因敲除这些基因工具,以及梭状芽孢杆菌菌的转录分析,但是通过控制电子转移和氧化还原平衡这些代谢工程途径提高丁醇比例和滴度仍是有限的。
由于梭状芽孢杆菌中电子流是受铁氧化还原蛋白氢化酶调节的,所以,采用反义RNA方法,抑制C.sa。。。。。。菌株中编码吸氢氢化酶的hupC基因的表达,结果显示,丙酮产量得到提高,但是丁醇产量减少。这说明以氢化酶和氢气生产作为靶向是一种可行的调节代谢的生物工程方法。
5.2.2生物工程过程
虽然梭状芽孢杆菌的基因改造过程繁琐耗时长,在ABE发酵条件下开发出的生物工程,
在工业生产上非常有竞争力。
当使用还原性底物甘露醇代替葡萄糖时,通过由突变的 C. Tyrobutyricum产生的丁酸可以得到16.0g/L高滴度丁醇(Yu et al., 2011),同样,通过C.
acetobutylicum ATCC 824产生的甘油和葡萄糖的混合物作底物时,可以生成更多醇和少量氢气(Vasconcelos et al., 1994)。除了人工电子流,从酸到醇的过程中,甲基紫和中性红能减少析氢量,影响碳转移(Girbal et al., 1995; Peguin and
Soucaille,1996)。这些结果表明,还原性底物能提供多种还原力,反向促进丁醇生成。 除了用比工业原料玉米淀粉更高级还原性物质增加还原当量,充入CO或提高氢分压抑制氢化,进而通过调节氧化还原平衡提高丁醇产量,例如,相比充入纯氮气产丁醇4.8g/L,充入含85%氮气和15%一氧化碳的混合气体,丁醇浓度增加至7.8g/L,并且丁醇滴度也显著增加。这些结果表明,在铁氧化还原蛋白到NAD(P)+阶段,一氧化碳和氢气可能会一直氢化酶活性和电子传递,从而提高NAD(P)H含量和酒精产量。
6结论
很多产品都是在微氧和厌氧条件下发酵生产的。虽然长时间来很多生产实践中都在使用这些发酵工艺,在控制成本上仍需努力探索,特别是在可持续发展中应更加关注乙醇和丁醇 这些生物燃料。因为氧化还原反应和氧化还原动态平衡是细胞内代谢的基础,ORP控制代谢产物的形态,这就为提高发酵产率提供了一种有效策略。凭借先进的技术可以检测出细胞内ORP值,分析基因的表达和ORP变化下蛋白质合成机制,这样就能从分子水平上和生物工程中了解反应机制,进而可以优化乙醇发酵和丁醇发酵过程,开发出优良菌株。