枯草芽孢杆菌H4培养条件的优化
天津农业科学TianjinAgriculturalSciences植物生理与生物技术
2009，15（4）：20-20-23
枯草芽孢杆菌H4培养条件的优化
李亚玲，赵玉洁，谢凤行，周可，张峰峰
（天津市农业生物技术研究中心，天津300192）
摘要：以枯草芽孢杆菌H4为试验材料，利用Plackett-Burman设计法，对影响菌体生长的7个因素进行了筛选，确定影响该菌
生长的主要因素为牛肉膏、转速、蛋白胨和NaCl；采用响应面分析法对其中3个重要因子的最佳水平进行研究。结果表明，当牛肉膏为8.635g/L，蛋白胨为13.737g/L，NaCl为5.345g/L，接种量6.25%，初始pH7，温度39℃，转速150r/min培养时，菌体密度显著提高，菌株H4的OD460值由0.899提高到了1.129。中图分类号：Q939.124
文献标识码：B
关键词：枯草芽孢杆菌；Plackett-Burman设计；响应面分析法；优化
DOI编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2009.04.007
OptimizationofGrowthConditionsofBacillusSubtilisH4
(TianjinResearchCenterofAgricultureBiotechnology，Tianjin300192，China)
LIYa-ling，ZHAOYu-jie，XIEFeng-xing，ZHOUKe，ZHANGFeng-feng
Abstract：AstrainofBacillussubtilisH4wasisolatedfromthemudofpound,andthePlackett-Burmandesignwasusedtostudythe7
factorsinfluencingthegrowthofBacillussubtilisH4.Theresultsshowedthatbeefextract,rotationalspeed,peptoneandNaClwerethetheconditionofbeefextract8.635g/L,peptone13.737g/L,NaCl5.345g/L,inoculation6.25%,initialpH7,temperature39℃andro⁃tationalspeed150r/min.
Keywords:Bacillussubtilis；Plackett-Burmandesign；responsesurfacemethod；optimization
mainfactors.Responsesurfacemethodologywasalsousedtoresearchtheoptimizationforthe3mainfactors,andtheresultsindicatedthattheconcentrationofBacillussubtilisH4wassignificantlyincreasedandtheOD460ofthebrothincreasedfrom0.899to1.129under
随着水产养殖业的迅猛发展和集约化经营程度的不断提高，养殖水体污染日趋严重，许多养殖池中有害藻类及病菌大量繁殖，水质条件不断恶化，其后果影响到了水产品安全和产业的可持续发展[1]。利用常规药物防治方法，不但易加重水质恶化程度，成本也较高，而利用微生物制剂改善养殖水体环境受到人们越来越多的关注[2,3]。枯草芽孢杆菌是一种好氧的革兰氏阳性菌[4]，在自然界广泛存在，生命力极强，代谢旺盛，对人畜无害，不污染环境，具有广谱的抗菌活性和极强的抗逆能力[5-7]。枯草芽孢杆菌能有效的降解水体中的氨氮、亚硝酸盐和硫化物[8-10]，达到净化水质的目的。因此，枯草芽孢杆菌在养殖水体的生物修复方面得到了广泛的应用。
用枯草芽孢杆菌H4发酵后经离心的菌体处理模拟养殖水，结果表明，H4能有效降解水体中
收稿日期：2009-04-03；修订日期：2009-06-28
基金项目：天津市应用基础与前沿计划项目（07JCZDJC03600）
的亚硝酸盐、氨氮，使水体中溶解氧含量逐渐升高。因此，菌体浓度是影响水体净化效果的主要因子之一。鉴于培养条件对菌体生长的影响，有必要对其进行优化，以获得较高的含菌量。本试验采用Plackett-Burman设计和响应面分析法对枯草芽孢杆菌发酵生产的相关影响因素进行了研究，以期从众多影响因素中快速有效地筛选出主要的影响因子，通过回归各因素水平及其相互作用与响应值之间关系的二次多项式，对各因子进行优化，确定较优的发酵条件，为后续的扩大培养和微生态制剂的开发应用提供理论依据。11.1
材料和方法
材料
菌株：枯草芽孢杆菌H4为本实验室分离保藏。
作者简介：李亚玲（1982-），女，河北人，研究实习员，硕士，主要从事微生态制剂研究。通讯作者为赵玉洁。
第4期
李亚玲等：枯草芽孢杆菌H4培养条件的优化
NaC1质量分数分别为1％、0.5％、0.5％，pH7.2～7.4；（2）固体培养基在液体培养基中加入质量分20min后，无菌分装备用。1.2
数2％的琼脂。培养基均经过高压1×105Pa灭菌
根据有关文献记载[11]以及本实验室对枯草芽
培养基：（1）液体培养基蛋白胨、牛肉膏、
22.1
结果与分析
培养条件优化试验设计
孢杆菌的前期研究，本次试验选取牛肉膏、蛋白胨、NaC1等培养基成分和温度、pH值、接种量、转速7个因素作为考察对象，并以枯草芽孢杆菌的菌体浓度为响应值，采用Plackett-Burman设计法筛选菌体生长的关键因素。通过响应面分析法中的中心组合设计，对其进行进一步研究，根据试验值得到各因素水平及其相互作用与响应值之间关系的二次多项式，通过回归此式对各因子进行优化，以获得该菌生长的最佳培养条件。
Run[**************]
牛肉膏X1
-11111-1-1-111-1-1
蛋白胨X2
-111-1-1-1-111-111
NaClX4
11-1-11-1-11-111-1
温度X5
1-11-111-111-1-1-1
Plackett-Burman设计确定重要因子
用MINITAB软件创建一个Plackett-Burman实
X6、X9为空项用验，每个因素取两个水平，其中X3、
以估计试验误差。选用N=12的Plackett-Burman设计表考察了7个因素对菌体生长的影响，试验设计及结果见表1。
对试验数据进行回归分析，结果见表2，牛肉膏、转速、蛋白胨和NaCl是主要影响因素，温度、pH和接种量的重要性相对较小一些。转速反映的是溶解氧含量的高低，溶氧含量的影响将在以后的发酵罐中进行测定。因此，摇瓶试验选定牛肉膏、蛋白胨和NaCl3个因素进行下一步试验。其余各因素的水平在后续试验中的调整如下：接种量6.25%，pH7，温度39℃，转速150r/min。
pHX7
1111-11-1-1-1-11-1
转速X8
-11-1111-11-1-1-11
接种量X10
1-111-1-1-11-11-11
试验OD值0.990±0.00051.003±0.00041.031±0.01290.987±0.00131.006±0.00050.940±0.00470.964±0.00280.983±0.00041.032±0.00161.006±0.00721.023±0.00910.960±0.0044
表1Plackett-burman设计与结果
注：表中所列数据是3个重复的平均值±3个重复的标准差，下同。
表2
编号
因子牛肉膏/（g·L-1）蛋白胨/（g·L-1）虚拟变量NaCl/(g·L-1)温度/℃虚拟变量pH值转速/（r·min-1）虚拟变量接种量/%
Plackett-Burman试验各因素的回归分析结果
水平510-1537-16150-15
6.2512.516.[1**********].25
0.00033
0.04
0.968
7
0.00400-0.02700
0.51-3.45
0.6370.026
62
0.017000.00733
2.170.94
0.0960.402
45
效应0.033000.02533
t值4.213.23
P值0.0140.032
重要性排序
13
X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10
天津农业科学第15卷
最陡爬坡试验逼近最大响应区域
Plackett-Burman试验回归分析确定牛肉膏、蛋白胨和NaCl为重要因素，且这3种组分对枯草芽孢杆菌的生长均是正影响，增加牛肉膏、蛋白胨和NaCl的浓度，考察发酵液OD值的变化趋势，逼近最大响应区域。试验设计和结果列于表3。
对于枯草芽孢杆菌的生长，温度、pH值、转速和接种量均固定在中心点的水平上。牛肉膏、蛋白胨和NaCl浓度对菌体的生长有积极的影响。表3列出了浓度改变的方向，即牛肉膏以浓度4.5g/L为起点，蛋白胨以9.0g/L为起点，NaCl以4.25g/L为起点，分别依次增加0.5个单位。从表3中可以清楚地看出，处理6的OD值达到最大为1.035，随后开始下降。因此，接下来的优化试验应该在处理6附近进行。2.2
表3最陡爬坡试验设计结果牛肉膏
Run1234567
（/g·L）
-1
归显著。决定系数R2=0.968，表明模型能解释96.8%菌液生长OD值的变化，回归拟合程度较好。方程给枯草芽孢杆菌的发酵提供了一个合
适的模型。利用MINITAB软件绘出了计算的三维响应面，证实了拟合面有真实的最大值，见图1。
对方程进行求导，可以得到模型的极值点为牛肉膏8.635g/L，蛋白胨13.737g/L，NaCl5.345g/L，此时模型预测的最大响应OD值为1.087。为验证模型预测的准确性，以该最佳工艺条件进行试验，结果见表7。由结果可知，试验值和预测值的相对偏差小于5％，证明此模型有效，可用方程代替真实试验点对枯草芽孢杆菌H4的培养进行分析和预测。
表4响应面分析法设计因子及水平列表编号
因子牛肉膏/（g·L-1）蛋白胨/（g·L-1-1-1.6823.68.1-15.09.5水平
07.011.519.013.51.68210.414.9蛋白胨（/g·L）
-1
NaCl（/g·L）
-1
X1
试验OD值0.873±0.00090.883±0.00720.935±0.00350.945±0.00280.977±0.00981.035±0.00381.020±0.0082
[***********][1**********]20Run
X24
X14.55.05.56.06.57.07.5
X29.09.510.010.511.011.512.0
X44.254.755.255.756.256.757.25
表5响应面分析试验设计及结果牛肉膏（/g·L-1）
蛋白胨（/g·L-1）
NaCl（/g·L-1）
试验OD值0.879±0.00080.890±0.00371.010±0.00301.016±0.00641.024±0.00091.028±0.00731.057±0.00561.037±0.00270.920±0.00331.066±0.00330.945±0.00241.069±0.00981.016±0.00151.025±0.00731.022±0.01241.033±0.00121.039±0.00061.032±0.00091.034±0.00151.038±0.0016
X1-1-1-1-11111-1.6821.[1**********]00
X2-1-111-1-11100-1.6821.[1**********]
X4-11-11-11-110000-1.6821.682000000
响应面分析法(RSA)确定最大响应值
最后采用响应面分析法对牛肉膏、蛋白胨和NaCl的浓度进行优化。试验设计采用中心组合设计，响应面分析法设计的因子及水平见表4，试验结果列于表5。
通过MINITAB软件的响应面回归过程对表5中的数据进行统计分析，建立二次响应面回归模型，并进而求解最优响应因子水平。经过整理，所得的分析结果见表6。试验数据拟合所得二次多项式方程为：
y=1.03300+0.03636X1+0.02984X2+0.00118X3-0.01417X12-0.00922X22-0.00444X32-0.01438X1X2-0.00412X1X3-0.00362X2X3
此方程二次项系数均为负值，抛物线的开口向下，因而有极大值点。模型的完备性可由方差分析及决定系数两方面考察，方差分析表明：F回归=33.14＞F9,10,0.01=4.95，表明模型在α=0.01水平上回2.3
X1=(x1-7)/2，X2=(x2-11.5)/2，X3=(x3-6.75)/2
第4期
李亚玲等：枯草芽孢杆菌H4培养条件的优化
表6响应分析法试验的回归分析结果
方差来源模型
线性回归部分
平方和0.0359890.030234
自由度93331055
均方
F值
P值
0.00399933.140.0000.01007883.510.0000.00128710.660.0020.0006315.230.0200.000121
0.0002055.560.0420.000037
3结论
本试验通过Plackett-Burman实验设计和响应
平方项增加部分0.003861交互项增加部分0.001894残差失拟误差
0.0012070.0010230.000184
面分析法，用较少的试验得到与实际拟合程度较高的模型。培养条件的优化结果为：牛肉膏8.635g/L，蛋白胨13.737g/L，NaCl5.345g/L，接种此时模型预测的最大响应OD值为1.087。在此优化培养基的基础上进行验证试验，菌株H4的OD值为1.129，比优化前的0.899提高了25.6%，菌数由9.6×108cfu/mL提高到1.5×109cfu/mL，芽孢数由3.8×106cfu/mL提高到4.5×107cfu/mL。本试验积累的工业化生产提供了理论依据和数据支持。
参考文献：
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量6.25%，初始pH7，温度39℃，转速150r/min。
和0.03719619
22
S=0.01099R=0.968Radj=0.938
a
的技术参数，为以枯草芽孢杆菌为主的微生态制剂
蛋白胨
牛肉膏
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-1
图1牛肉膏-蛋白胨(a)、牛肉膏-NaCl(b)、蛋白胨-NaCl(c)
交互影响菌体浓度的响应面图表7优化前后试验结果比较
培养条件优化前优化后
OD460nm值菌数/(cfu·mL)芽孢数/(cfu·mL)
-1
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0.8991.129
9.6×101.5×10
89
3.8×104.5×10
67