克隆的筛选和快速鉴定
实验六克隆的筛选和快速鉴定
一、目的
掌握快速细胞破碎法测定大小不等的众多的质粒DNA ；和菌落PCR 快速鉴定克隆。
二、原理
在这个实验方法中，只需配制一种细胞缓冲液（它可以在室温下保存，长期使用）。利用破碎细胞缓冲液中的阴离子去污剂SDS 在37℃溶解膜蛋白，使细胞破裂，并解聚核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合形成复合物，使得蛋白质沉淀。利用EDTA 螯合金属离子，防止破碎细胞的脱氧核糖核酸酶对DNA 的降解。然后高速离心，去除细胞碎片核大部分的染色体DNA 和RNA 蛋白，将含有质粒DNA 的上清夜直接进行点样电泳和分离。在琼脂糖凝胶上分离开的个组分中，有染色体DNA ，不同大小的质粒DNA 和RNA ，它们都可以经肉眼观察或拍照显示。
或者用设计好的引物，做菌落PCR 快速鉴定克隆。
三、试剂与仪器
（一）试剂
1．破碎细胞缓冲液50mmol/L Tris-HCl (pH6.8)、1% SDS、2mmol/L EDTA、400mmol/L蔗糖和0.01%溴酚蓝。
配制方法：1mol/L Tris-HCl (pH6.8) 10ml
20% SDS 10ml
250mmol/L EDTA 1.6ml
蔗糖27.2g
1.2%溴酚蓝 1.67ml
加ddH2O 至200ml
2． 10mg/ml 溴乙啶
3． TBE 电泳缓冲液（5×）
4．Taq DNA聚合酶(5U/μl)
5．10×反应缓冲液（含25mmol MgCl2）
6．dNTP
7．点样缓冲液Loading buffer（10×）：0.25%溴酚蓝，40%甘油。
（二）仪器
1．电泳仪2．1.5ml 离心管3．Tip
4．培养皿5．PCR 扩增仪 6．台式离心机
7．紫外分析仪 8．恒温水浴
四、操作步骤
（一）快速细胞破碎法测定
1．取1.5ml 离心管编号码，每管加入50μl破碎细胞缓冲液。
2
3．待转化的细菌菌落长到2mm 时
4．用牙签挑取单克隆点在作好标记的方格内，然后挑同一克隆加入对应1.5ml 离心管中（离心管中已加入50μl破碎细胞缓冲液）。
5．培养皿37℃培养6小时后4℃保存。
6．离心管于37℃水浴中，保温15分钟。
7．12000rpm ，离心15分钟。
8．取上清约25μl，进行琼脂糖凝胶电泳。（胶浓度为1%）
9．紫外灯进行结果分析。
（二）菌落PCR 快速鉴定法
1．直接用牙签或接种针挑取少许菌体加入20μl PCR反应体系中。
2．用通用引物或特异引物进行PCR ，根据扩增条带的有无和大小来判断插入片段的有无、大小及方向（反应体系参照前面实验）。
试剂
模板
10 x buffer
10×dNTP
Primer P1
Primer P2
ddH 2O
Taq 酶 3．0.8%琼脂糖凝胶电泳（样品全部点样）。
4．观察并记录结果。 体积（20μl） 单克隆菌体 2μl 2μl 1μl 1μl 补足到20μl 2U