超声波对β-果糖基转移酶催化活性的影响
超声波对β-果糖基转移酶催化活性的影响
Effect of ultrasound on catalytic activity of β-fructosyltransferase
覃益民
QIN Yi-min 11唐江涛1魏远安2姚评佳2TANG Jiang-tao 1WEI Yuan-an 2YAO Ping-jia 2
(1.广西大学化学化工学院，广西南宁530004；2.广西大学生命科学与技术学院，广西
南宁530004)
(1.Schoolof Chemistry and Chemical Engineering , Guangxi University, Nanning，Guangxi530004,China；2.Collegeof Life Science &Technology,Guangxi University, Nanning，Guangxi530004,China)
摘要:研究超声波在不同功率及作用时间下对FTS 的影响效果。结果表明：超声波在一定作用参数下能提高FTS 催化活力，在20kHz 、300W 功率下（有底物存在时为250W）作用5min 提高的酶活力最大，比对照提高了约12%。经荧光光谱分析,在无底物存在时，FTS 经超声波处理后，其荧光发射波长发生了红移，最大发射波长由343nm 变为348nm，荧光强度有所提高；而有底物存在时，经超声波处理前后的FTS 荧光光谱无明显变化。
关键词:β-果糖基转移酶；催化活性；超声波；荧光光谱分析
Abstract:The effect of ultrasound on catalytic activity of the enzyme was investigated. The results showed that ultrasound treatment with suitable
parameters could increase the enzyme activity. The optimum parameters for the enzyme were 20kHz, 300W(250W in presence of substrate) and 5min,with raising the catalytic activity by12%.The conformation change of FTS was also analyzed using fluorescence spectroscopy. In absence of substrate, after ultrasound treatment the fluorescence intensity of FTS increased and its emission wavelength was redly shifted (from343to 348nm). In presence of substrate, however, the fluorescence intensity and emission wavelength of ultrasound treated FTS exhibited a slight change.
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基金项目：国家自然科学基金资助项目(项目编号：29772096)
作者简介：覃益民（1962-），男，广西大学化学化工学院副教授、在读博士。
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收稿日期：2007-05-11
Keywords:β-fructosyltransferase；Catalytic activity；Ultrasound；Fluorescence spectra analysis
低聚果糖作为一种新型的功能性甜味剂、优良的食品添加剂，越来越受到人们的关注[1～3]。β-果糖基转移酶(β-fructosyltransferase,EC 2.4.1.9,FTS)是由蔗糖合成低聚果糖的主要酶[4]，在霉菌、酵母及植物中均有分布。近年来,随着酶制剂工业的发展,人们除了在探索利用低成本原料、高产量来提取酶外，同时又探索利用价廉的外在手段提高酶的活力及增强其稳定性。
超声波是物质介质中的一种弹性机械波，作为一种物理能量形式，它在食品、化工及生物工程领域得到了广泛的应用[5，7]。应用于酶学方面的研究也有不少报道,一些研究发现，适当强度超声波作用能提高一些生物酶的催化活性[8～10]，但也有超声波作用使生物酶的催化活性下降的报道[11]。可见,超声波对酶的催化活性有着一定的影响,而其影响对不同的酶有不同的作用效果。因此，超声波对酶催化过程影响的研究将对酶学理论产生积极的影响,在酶的工业生产及利用方面也有很大的应用前景。米曲霉GX0011是作者自行诱变筛选并已用于低聚果糖工业化生产的菌株，本研究试图确定声场能量与FTS催化活性的关系,并利用荧光光谱分析探讨超声波影响酶活性机理，望能给酶学研究和FTS的工业应用提供一定的参考价值。
1材料与方法
1.1FTS提取及纯化
自行筛选的米曲霉：培养36h,发酵液离心,收集菌体,球磨机将菌体破碎,用冷冻超速离心机将酶液离心得到上清液，经过热变性处理、硫酸铵分级沉淀、再依次经DEAE-Sephadex A50弱阴离子交换柱，Octyl-Sepharose Cl-4B疏水层析柱，Sephacryl S-300凝胶柱进行分离纯化步骤，获得凝胶电泳均一的蛋白酶样品，比活力为1665U/mg。
1.2酶活力测定
用pH5.5,50mmol/L磷酸缓冲液配成10%的蔗糖溶液作底物,加入适量的酶液,置于40℃水浴中振荡反应40min后,立即于沸水浴中加热15min,终止反应，用WATERS高效液相色谱仪测定产生的蔗果三糖量。酶活定义为在上述反应条件下，每分钟产生1μmol蔗果三糖所需的酶量为1个活力单位。
1.3超声波对FTS催化活性影响试验
将FTS（无底物时）、FTS与蔗糖混合液（有底物时）在JY92-2D型超声波细胞破碎机上用一定参数的超声波处理后，立即进行活力测定。用未经超声处理的酶液为对照，以考察经超声波处理后酶活力变化情况。试验平行重复3次，用方差分析法对作用的显著性进行分析。
1.4荧光光谱测定
FTS的荧光光谱采用RF-5301PC型荧光分光光度计在室温下测量，荧光池光径为1cm，激发谱宽为3nm，发射谱宽为1.5nm,激发波长280nm，扫描速度为快速。
2结果与讨论
2.1不同功率超声波对果糖基转移酶酶活的影响
用20kHz、50～650W的超声波处理不含底物及含底物的FTS酶液5min后测定酶活，结果见图1。图中的相对酶活为经不同功率超声波处理后酶活与未经超声波处理的酶活之比。图1表明:无论是否有底物存在，所测得的酶活性在作用功率小于450W范围内都有一定的提高，无底物时在300W处、有底物时在250W处达到最大值,此时的酶活性比对照提高了约12%。但当作用功率大于550W时，酶活出现下降现象。方差分析表明:不同功率超声波处理酶的效果达到显著水平（表1）。
有文献报道在无底物时超声波会使酶活力降低，大功率的超声波也会使酶失活[12][13]。本研究中在作用功率小于450W 范围内没有出现酶活力对比下降现象，且FTS 的激活最适功率为250～300W，属于大功率。因此推测FTS 在本试验的声强范围内很稳定，要想通过超声波作用来适当改变该酶分子状态从而提高催化功能，所需功率相对来说会高些。但超过一定范围的大功率（如本试验大于550W）作用，酶活力确实会下降，如用650W 处理时，在无底物存在下酶活下降了约15%，但有底物存在时，酶活却只有约2%的下降，说明此时底物的存在对酶活力有一定的稳定作用。
相对酶活(%) 超声波功率(W)
图1不同功率超声波对FTS 酶活力的影响
表1不同功率超声波对FTS 活性的影响方差分析
项目
不同功率
处理
误差无底物有底物无底物
有底物自由度10平方和1469.7494.464.762.7均方147.049.42.942.85F 值51.5816.82临界值F 02.5322
2.2不同作用时间超声波对果糖基转移酶酶活的影响
相对酶活(%) 作用时间(min)
图2超声波作用不同时间对FTS 酶活力的影响
在20kHz 、250W 功率下,用超声波对FTS 作用不同时间,结果见图2。从图2可看出,超声波作用时间的长短对酶活是有影响的,酶活提高百分比最高的时间段大约在4～6min,超声波作用时间过长反而会使酶的活性出现下降的趋势。如超声波作用12min 后，酶活降低达10%以上。同时经方差分析表明：不同时间超声波处理酶的效果达到显著水平（表2）。
表2用超声波处理不同时间对FTS 活性的影响方差分析
项目
不同时间
处理
误差无底物有底物无底物
有底物自由度12平方和1038.6679.479.1577.56均方86.5556.623.042.98F 值28.4718.69临界值F 02.2426
2.3FTS 超声波处理前后的荧光光谱分析
荧光光谱法是研究蛋白质在水溶液中分子构象变化的一种有效方法[14]。它能提供包括激发光谱、发射光谱以及荧光强度、量子产率等许多物理参数，这些参数从各个角度反映了分子的成键和结构情况，可以推断蛋白质分子在各种环境下的构象，从而阐明蛋白质结构与功能的关系。研究表明[15，16]，当蛋白质在水溶液构象由有序到无序变化时，其荧光发射波长一般会发生红移，荧光强度也会变大。图3、图4为FTS 经超声波处理前后的荧光
光谱谱图。
2.3.1无底物时FTS 的荧光光谱分析当无底物存在时，从图3可看出，末经超声波预处理的FTS 的荧光发射波长为343nm（图中a），而经不同功率超声波预处理后FTS 的荧光发射波长均发生了红移，且强度有所增强。在300W 处（此时酶活性提高最大），FTS的荧光发射波长变为348nm（图中f），波长发生了5nm 红移。故可推测酶经超声波处理后FTS 构象发生了明显变化，且酶分子构象变得更为松弛，因而有利底物进入酶的催化部位及产物扩散出介质，从而提高了酶的催化效率。此后，随着处理功率的增加，红移及强度增加的幅度不大。但在650W 处（此时酶活性降低约15%），波长红移及强度增加的幅度出现了一个小突跃（图中k），表明酶分子的构象发生了较大的变化，从而引起酶活的降低。
荧光强度a ：未经超声波处理；
450，550，650W ，200，250，300，350，
图3无底物时超声波处理前后FTS 的荧光光谱
2.3.2有底物时FTS的荧光光谱分析有底物时经不同功率超声波预处理的FTS荧光光谱谱图见图4。此时，FTS的荧光发射波长约为345nm（图中c—l），与无底物时末经超声波预处理的光谱（图中a）相比也发生了2nm左右的波长红移，且荧光强度均有所下降。波长红移也预示着酶分子本身发生了构象变化，以形成反应活性更高的中间物。至于荧光强度的下降可能是酶分子中的荧光基团Tyr或Trp作为该酶的活性中心基团参与了中间物的形成所致。但与有底物时末经超声波预处理的FTS光谱（图中b）相比，其发射波长
变化不明显，其强度随处理功率增加而略微增大，说明与前面在无底物时所推测的超声波作用使FTS构象发生变化是提高酶催化效率的原因可能有所不同。
荧光强度a-无底物未经超声波处理；b-有底物未经超声波处理；c—l-处理10min、功率分别为50，100，150，200，250，
300，350，450，550，650W
图4有底物时超声波处理前后FTS 的荧光光谱
综上所述，无论是否有底物存在，超声波作用确实在一定程度上能提高FTS 的催化活力,且FTS 活力的提高与超声波作用的功率及时间有关。通过荧光光谱分析可认为在无底物存在时超声波处理引起了FTS 酶分子构象的改变是促进该酶催化活性提高的原因之一，而有底物存在时，经超声波处理前后的FTS 荧光光谱变化不明显。
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