三七提取液中三七总皂苷的分离纯化工艺研究
() () 文章编号: 1007-6611(2006) 06-0613-03
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三七提取液中三七总皂苷的分离纯化工艺研究
谢 茵, 邢桂琴, 刘秀芬 (山西医科大学药学院药剂教研室, 太原 030001)
摘要: 目的 研究影响分离纯化三七总皂苷的几个主要影响因素, 确立三七总皂苷分离纯化工艺。 在确立三七总皂苷测定方法的基础上, 采用HPD 2100型大孔吸附树脂, 以每ml 含0. 4g , 上柱量为1. 5倍柱体积, 并以1柱体积/h 的速度通过树脂柱, 。 ,2-3倍柱体积/h 的速度洗脱, 用量为5-6倍柱体积时, %, 79. 6%, 精制度为241%。 结论 HPD 2100大孔吸附树脂可用于富集、, 关键词: 三七总皂苷; ; ; 中图分类号: Study on the and purif ication of radix notoginseng saponin
XIE Y in , XIN G Gui 2qin , L IU Xiu 2fen (Dept of Pharm aceutics , Pharm acy College , S hanxi Medical U niversity , Taiyuan 030001, China )
Abstract : Objective To optimize the major conditions for the separation and purification of radix notoginseng saponin. Methods
On the basis of determining radix notoginseng saponin , HPD -100macroreticular resin was used for enriching radix notoginseng
saponin. The extraction of 0. 4g material/ml was adsorbed in 1. 5times of column volume at a speed of one column volume per hour.
Results The extraction was eluted by 70%ethanol of 5-6times with column volume at a flow rate of 2-3folds column volume
per hour. Elution ratio of radix notoginseng saponin was more than 98%, purity was 79. 6%, polishing was 241%. Conclusion HPD 2100macroreticular resin can be used to enrich , separate and purify radix notoginsen saponin ,and the effect is better. K ey w ords : radix notoginseng saponin ; HPD -100macroreticular resin ; elution ratio ; polishing
三七(Radix Notoginsen ) 为五加科人参属植物三七[Panax Notoginseng (Burk. ) F. H. Chen 〗的根, 具止血、活血化瘀和消肿止痛的功效[1]。目前大多用于冠心病、心绞痛及脑血管病等心脑血管疾病的防治。现代药理研究证明三七药材所含有的三七总皂苷具有多方面的药理活性, 是其发挥药效的重要活性成分[2]。
三七总皂苷的测定方法, 文献上已有许多报道, 最常用的是大孔吸附树脂-(香草醛/高氯酸) 比色法[3,4], 由于大孔吸附树脂技术除去干扰成分效果好, 操作简便, 样品损耗少, 成本低, 污染小, 因而本文拟采用以上方法测定三七总皂苷的含量, 并进行方法学考察。三七提取物常采用正丁醇萃取及大孔吸附树脂分离技术进行纯化。大孔吸附树脂是近10余年发展起来的一类有机高聚物吸附剂, 它具有较好的吸附及分离性能, 近年来, 大孔树脂广泛用于天然产物的分离, 为分离有机化合物尤其是水溶性化合物的有效手段, 在天然产物化学成分的提纯等方面显示了独特作用。目前在中草药的分离纯化中已有较多应用, 唐第光等[5]应用D 101型大孔吸附树脂已对三七总皂苷进行了分离提纯,
孙永慧等[6]又对纯化三七皂苷所用大孔树脂不同型号进行了选择, 认为D 101、AB 28及HPD 2100的效果较好而且十分接近。
资料介绍[6]D 101、AB 28、HPD 2100等树脂均可用于富集、分离纯化三七总皂苷, 其中D 101及HPD 2100均为聚苯乙烯结构的非极性大孔树脂且表面积
均为400-500m 2/g , 但HPD 2100为D 101升级换代产品,AB 28为弱极性树脂, 为此对AB 28和HPD 2100两种树脂进行选择。1 仪器与试剂
6010紫外/可见分光光度计, 安捷伦科技(上海) 有限公司产品; 定量分析用人参皂苷Rg1对照品, 中国药品生物制品检定所; 三七药材购于山西省药材公司; 其他试剂均为分析纯; HPD 2100大孔吸附树脂, 河北沧州宝恩化工有限公司;AB 28大孔吸附树脂, 南开大学化工厂。2 方法与结果2. 1 三七总皂苷的含量测定
2. 1. 1 三七总皂苷上柱液的制备 取三七粗粉(10-20目) 适量, 加12倍量70%乙醇, 置水浴上温
) 提取160min , 共三次, 提取液放冷, 滤过, 热(65℃
・614・() () 及重复性良好, 回收率在99%, 因而本法测定结果
准确可靠。2. 2 大孔吸附树脂的选择2. 2. 1 上柱液的制备 见2. 1. 1。2. 2. 2 大孔吸附树脂柱的制作 取AB 28型大孔
滤液回收乙醇, 残液加水溶解, 室温放置过夜, 离心
(3000r/min ,10min ) , 离心液加水稀释成含药材0. 4g/ml 的上柱液。
2. 1. 2 HPD 2100型大孔吸附树脂柱的制备 取HPD 2100型大孔吸附树脂10g , 用乙醇浸泡, 湿法装柱(1. 5cm ×20cm ) , 用水洗至无醇味, 即可应用。2. 1. 3 供试品溶液的制备 取上柱液2ml , 置于HPD 2100大孔吸附树脂柱的上端, 以0. 1-0. 3ml/min (0. 33-1BV/h ) 的速度使吸附, 等杂质至Molish 反应阴性, 用70%0. -019ml/min (2-3BV/-, 。2. 1. 4 60℃减压干燥至恒重的三七皂苷Rg1对照品2. 42mg 于25ml 量瓶中, 加甲醇溶解并稀释到刻度, 摇匀, 即为每ml 含0. 0968mg 的对照品溶液。精密吸取0, 0125,0. 50,0. 75,1. 00,1. 25ml 的对照品溶液, 分
吸附树脂10g , 加乙醇浸泡, 湿法装入层吸柱中(115cm cm ) , , 3BV 乙醇以2-, ml 水不产生混浊为止, 用再用3BV 5%稀盐酸以2-3BV/h , 用水洗至中性, 再用2%NaOH溶液同法处理后, 用水洗至中性, 即可应用。见2. 1. 2。2. 2. 3 供试品溶液的制备 取上柱液30ml ,6份, 分成两组, 每组3份, 分别置于3个AB 28及3个HPD 2100大孔吸附树脂柱的上端, 以0. 1-0. 3ml/min 的速度吸附, 再用水洗除杂, 用100ml 70%乙
别置于10ml 具塞试管中, 挥干溶剂, 加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0. 2ml , 高氯酸0. 8ml , 在60℃水浴中加热15min , 立即置冷水中冷却, 加入冰醋酸5ml 摇匀, 放置15min , 相应试剂随行空白对照, 在波长560nm 处测定吸收度A , 以吸收度为纵坐标, 三七皂苷Rg1含量(mg ) 为横坐标, 求回归方程为:Y =5. 270X +0. 0511, r =0. 9995。结果表明三七皂苷Rg1在0. 02425-0. 12125mg 之间, 有良好线性关系。2. 1. 5 含量测定 吸取供试品溶液, 挥干溶剂, 照标准曲线制备项下方法自“加入新配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0. 2ml ”起, 依法测定吸收度, 并用回归方程计算含量。2. 1. 6 回收率试验 精密吸取上柱液一定量, 共10份, 其中5份分别加入三七皂苷Rg11. 94mg 、1187mg 、1. 85mg 、2. 24mg 、2. 76mg , 溶解并混匀, 其余5份供测定上柱液中三七总皂苷含量用, 以上10份溶液分别置于制备好的HPD -100树脂柱上, 水洗除杂质后, 用70%乙醇洗脱至醋酸酐-浓硫酸反应阴性, 收集洗脱液, 取一定量按标准曲线项下操作, 测定吸收度, 计算, 即得结果。三七药材中三七总皂苷含量为7. 52%, RSD =2. 20%; 回收率99. 2%,RSD =2. 53%。
通过以上方法学考查认为:用大孔吸附树脂—(香草醛-高氯酸) 比色法测定三七提取液中三七总皂苷含量, 去干扰成分效果好, 方法稳定, 精密度
醇, 以0. 6-0. 9ml/min 的速度洗脱, 分别收集洗脱液, 作为供试品溶液。2. 2. 4 三七总皂苷的含量测定 精密吸取以上两种供试品溶液适量, 挥干, 按2. 1. 5法测定得提取液通过AB 28型和HPD 2100型大孔吸附树脂制备的三七总皂苷平均含量分别为662mg 、845mg 。结果表明:提取液通过HPD 2100型大孔吸附树脂制备的三七总皂苷高于AB 28型树脂, 经t 检验得P
用100ml 70%乙醇洗脱, 另3个柱用100ml 50%乙醇洗脱, 两柱均以0. 6-0. 9ml/min 的速度洗脱, 分别收集洗脱液, 作为供试品溶液。测得70%和50%乙醇为洗脱剂的三七总皂苷平均率分别为6151%和7. 48%, 经t 测验得P
() () 为0. 4g 药材/ml 。以上三种浓度的上柱液中三七总皂苷的含量均为7. 52%(三七总皂苷/三七药材) 。2. 3. 3 上柱液体积及洗脱剂用量的确定 取上柱液置于已处理好的HPD 2100大孔吸附树脂柱上, 以0. 1-0. 3ml/min 的速度通过树脂柱并按顺序收集
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由图2洗脱曲线可知, 当洗脱液体积为100ml 时(约为柱体积的5倍) 可洗脱三七总皂苷的量为1205. 72mg , 占总吸附量1226. 6mg 的98. 3%, 可满足工业生产的要求, 因而确定洗脱剂用量为5倍柱体积的70%乙醇。
2. 3. 4 精制度 取25ml , 置于HPD 2100, , 收集洗脱液ml 。、恒重,
流出液10ml 共11个。水洗除杂至Molish 反应阴
性, 收集除杂液1050ml 。再用70%乙醇以0. 6-019ml/min 的速度洗脱, 按顺序收集10ml 15个。测定以上流出液、除杂液、皂苷量。; 图2
。
9. 48%, 依2. 1. 5法7. 51%。并测得精制前后纯33%和72%, 得精制度为240%。2. 4 重复试验及结果 根据以上试验确定的工艺, 取0. 4g 药材/ml 上柱液25ml 5份, 分别置于5支HPD 2100树脂柱的上端, 以1BV/h 速度过柱, 水洗至Molich 反应阴性, 用100ml 70%乙醇以2-3BV/h 速度洗脱, 测定洗脱液中三七总皂苷量, 结果药材中三七总皂苷含量分别为(三七皂苷/三七药
材) :7.53%,7. 49%,7. 40%,7. 45%,7. 42%, X =7. 46%,RSD =0. 7%, 三七皂苷收率为99. 2%。3 讨论 吸附树脂-(香草醛-高氯酸) 比色法, 测定三七总皂苷含量, 方法简便, 污染少, 但因该法显色受温度、时间等环境因素影响较大, 因而在测定时宜每次随行标准列, 才有可比性。 研究结果表明用HPD 2100型大孔树脂吸附法富集纯化三七总皂苷, 精制度达240%, 洗脱率达98%以上, 由此从精制度、洗脱率(解吸度) 方面考虑,HPD 2100型大孔吸附树脂适宜于三七皂苷的分离纯化, 通过中试研究可应用于工业生产。
参考文献:
[1] 江苏新医学院. 中药大辞典(上册) [M ].上海:上海科学技术出
版社,1975:54-55.
由图1吸附曲线可知, 上柱液为30ml 时产生
泄漏(含12g 三七药材,904. 8mg 三七总皂苷) , 因而上柱量以不超过以上量为宜, 经试验当上柱液为25ml 时(1. 5BV ) , 可洗脱740mg 三七皂苷, 是25ml 三七上柱液中三七总皂苷量(754mg ) 的9811%, 因而确定当树脂量为10g 时, 上柱量以≤10g 药材或≤754mg 三七皂苷为妥, 即药材与树脂
[2] 黄泰康. 常用中药成份与药理手册[M ].北京:中国医药科技出
版社,1994:124.
[3] 中国医学科学研究院. 中草药现代研究(第二卷) [M ].北京:北
京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1995:432.
[4] 章观德. 吸附树脂法测定三七及其制剂冠心宁总皂苷[J].中草
药,1981,12(11) :23-25.
[5] 唐第光. 大孔吸附树脂法提取三七总皂苷工艺探讨[J].中成
药,1990,12(8) :5-7.
[6] 孙永慧, 李文春, 刘相辉. 人参标准提取物制备工艺初探[J].基
的比例应≤1∶1, 三七皂苷与树脂的比例应≤010754∶1, 上柱液为1. 5倍柱体积(1. 5BV ) 。此外尚可计算出在以上条件下上柱液泄漏前HPD -100型树脂对三七总皂苷的吸附容量为74mg/g 。
层中药杂志,2001,15(3) :6-7.
作者简介: 谢茵, 女,1960-11生, 大专, 高级实验师.
[收稿日期: 2006-01-05]