植物组织培养实验

植物组织培养实验报告

姓名： 覃丽静

学号： [1**********]026 学院： 园艺园林学院

年级： 10级

专业： 园艺（花卉与景观设计方向）

任课老师： 朱靖杰

班1

外植体表面消毒和接种简介

培养材料的灭菌与接种是组织培养过程中一个重要的环节。因此，在学习植物组织培养课程中我们需要领会无菌培养对实验材料消毒，接种的要求，并掌握培养材料灭菌，接种的操作技术。下面简要介绍外植体表面消毒和接种的原理，需要的器材，操作过程以及注意事项。

一． 实验原理

组织培养的主要过程都是在无菌条件下进行的，这意味着在培养过程中，必须防止和消除细菌，真菌，藻类以及一些微生物的感染。所有培养基，培养瓶，器材和植物材料本身均需要严格消毒。无菌是所有植物培养成功的前提。

植物体内带有各种各样的微生物，一旦与培养基接触，这些微生物就会迅速繁殖，导致实验失败。对于初代培养来说，为了得到无菌的材料，材料的选择，消毒灭菌和接种都十分重要。

对材料表面消毒，所用消毒剂种类、浓度和处理时间，要根据材料带菌情况、材料对消毒剂的敏感程度及消毒效果、材料类型及老嫩程度，通过实验优化。

外集体表面消毒的步骤一般可概括为：流水冲洗一个小时左右，70％酒精浸泡数秒或更长时间。0.1％~0.2％HgCl2浸泡5~15min（或2％~10％NaClO浸泡10~30min），无菌水泥冲洗4~5次。

对于初代培养来说，及使进行表面消毒，污染仍然是难免。为了提高无菌材料培养的获得率，减少工作量，初步接种每管放一块材料而不放2块或更多，采用大量小试管将材料分散是最有效的策略。

植物组织培养接种是把经过表面消毒的植物材料切碎或分离出器官、组织、细胞，并将它们转到无菌培养基上的全部过程。整个过程需无菌操作。

一． 实验材料

在培养过程中主要用到的实验材料有：镊子，解剖刀，酒精灯，脱脂棉，烧杯，广口瓶，培养皿，废液缸，无菌滤纸，银杏叶片，甘薯叶片，花卉蔬菜果树种子，带腋芽嫩茎。

二． 实验仪器

超净工作台

三． 实验试剂

0.1％氯化汞，酒精，次氯酸钠，无菌水，培养基母液

五．实验步骤

1．准备好培养基，无菌水，培养皿和接种工具。

2.将培养基，无菌水，接种工具至于接种台，打开超净工作台紫外灯开关，同时打开接种室内的紫外灯，用紫外灯照射至少15~25分钟，然后关闭室内的紫外灯，开送风开关，关闭台内的紫外灯，通风10分钟后，再开日光灯进行无菌操作。

3.接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗净，然后用沾有75％酒精的棉球将手消毒一次。

4.将银杏叶 片，甘薯茎段，黄瓜种子等在流水下冲洗干净。

5.在超净工作台上将银杏叶片用刀片切成2cmＸ2cm的小块，将甘薯茎段切成2cm切段，将银杏叶片，甘薯茎段或黄瓜种子放在一培养皿中，用75％酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，然后用0.1％氯化汞溶液或10％次氯酸钠溶液（加入吐温2滴）浸泡3~10min ，期间不断摇滚溶液，倒掉无菌水洗涤4次待用。

6.解除三角瓶上捆扎的线绳，用沾有75％酒精的棉球把三角瓶表面擦一下，把三角瓶按培养基处理整齐排列在接种台左侧，然后用75％酒精擦洗接种台表面。

7.接种用的镊子使用前插入75％的乙醇溶液中，使用镊子时在酒精灯上烧红，冷却后待用。也可以插入培养及边缘促使其冷却。每次取出时剪口并拢，不可以接触磨口瓶和其他器皿，并保持尖端向下：剪、镊分别在

酒精灯外焰彻底燃烧，燃烧时将剪口张开，烧至剪、镊上部， 火焰熄灭后，插回磨口瓶。

8.在酒精灯火焰旁揭去封口膜或棉塞，将瓶口倾斜接近与水平方向，用火焰灼烧瓶口，灼烧时应不断转动瓶口，左手持瓶，使其靠近火焰，右手将烧过的镊子触动培养基部分，使其冷却，夹取银杏叶片或黄瓜种子，将其放在培养基上，用镊子轻轻一按，使其部分浸入培养基。瓶口可放4~6个外植体。

9.转动瓶口灼烧，将其封口膜在酒精灯火焰上过一下，盖上封口膜，扎好绳子，标上接种日期，材料名称，培养及类型及激素浓度，姓名等。

10.将接种材料转移到培养室光照或黑暗培养。

六．注意事项

在对外植体的消毒与接种过程中必须要注意一下几点：

1.从室外剪去的材料，要用自来水冲洗数分钟，对表面不光滑或长有绒毛等不容易洗净的材料，冲洗时间要长，必要时用毛刷刷洗。

2.外植体消毒剂的选择要综合考虑消毒效果、不同材料对灭菌剂的耐受力，灭菌剂的去除效果，最好选用两种消毒剂交替浸泡，初次实验灭菌时间要设置一定的时间梯度来确定最佳的面菌时间。

3.面赛不能乱放。手拿回的部分限于棉塞膨大的上半部分，塞入瓶口的那一段始终悬空，并不要出碰到任何物体：若是螺旋盖或薄膜，则应解下放置在灭过菌的台面上，放置在处应随时用酒精棉团涂抹灭菌。

4.工作台接种时，操作人员的头、胳膊等不得进去台内。应尽量避免做明显扰乱气流的动作，以免影响气流，造成污染。另外在从操作过程中应不时用75％酒精擦拭双手。

5.进入接种室前，应将手表，手镯，戒指，耳环等放在室外，将手和手腕用肥皂洗净后才能进入接种室，并用75％酒精擦拭双手，双腕之后换上消毒工作服，帽子，口罩（盖上鼻子和嘴、着装是注意头发不得之帽子外，袖口用皮筋扎紧）进入台内。操作前用台内的酒精棉团擦拭双手，手

腕，再擦培养基和超净工作台，一般按如下顺序擦拭培养瓶：平的棉塞，平伸、瓶底，彻底擦拭后放入超净工作台中。

6.接种前培养基出现大量污染现象，因此要保持环境清洁，杜绝使用污染的母液，严格高压蒸汽灭菌程序，保证灭菌时间。

7.接种后培养基出现大面积污染，菌落分布不均匀，避免此现象发生的方法是：保持无菌接种室洁净，并定期用甲醛等熏蒸灭菌；在接种前无菌室用紫外灯灭菌时间部低于20~30min。用75％酒精喷雾杀菌降尘，超净台开启15~20min后方可使用；镊子等接种工具严格彻底灭菌，切接种时使用一次，灭菌一次；操作过程中经常用75％酒精等消毒剂擦洗手部措施。

8．接种后外植体周围发生菌类污染可能因外植体表面灭菌不彻底所致。解决方法是：外植体用饱和洗涤剂浸泡10~15min，自来水冲洗

0.5~2h后，在选择适宜的灭菌剂消毒，一般用0.1％~0.2％氯化汞灭菌最好。对于一些凹凸不平或有绒毛的外植体采用灭菌剂中加“吐温-80”等湿润剂的办法，增加其渗透性，以提高杀菌效果。

9.氯化汞为剧毒药品，使用时要注意，不要溅在皮肤上。

10.操作人员的呼吸也是污染的主要途径，通常在平静呼吸时细菌是很少的，但谈话或咳嗽时细菌便增多，因此操作过程中应严禁不必要的谈话并戴上口罩。

对培养材料进行表面消毒接种后，每天观察外植体的污染情况。如果培养材料大部分发生污染，说明消毒剂浸泡的时间过短；若接种材料虽然没有污染，但材料已发黄，组织变软，表明消毒时间过长，组织被破坏死亡；接种材料若没有出现污染，生长正常，即认为消毒时间适宜。