平滑肌肌动蛋白a-actin免疫荧光法鉴定
抗平滑肌肌动蛋白a-actin 免疫荧光法鉴定
细胞爬片制作
(1)细胞生长融合时，用O 25％含EDTA 的胰酶消化，制成细胞悬液。
(2)直径35mm 的细胞培养皿中放置3张玻片。
(3)每张盖玻片滴加细胞悬液l 50ul的密度是1×104个／ml 悬液．接种均匀。
（4）轻轻盖上盖子后．将其放入普通培养箱，待细胞贴壁后加入10％培养液
2ml 。
(5)培养24小时后，取出平皿，放在倒置相差显微镜下观察．挑选密度均
匀玻片，用无血清的DMEM 静止24小时后，即可用于实验。
免疫荧光结果：采用特异的平滑肌细胞表面标志物a-actin 细胞免疫荧光染
色后，胞浆着色为红色．表示细胞阳性。高倍镜下可见胞浆内与细胞长轴平行的
纤维细丝，即平滑肌a 肌动蛋白丝。
物品准备：PBS 溶液(pH 7．4) 、4％多聚叫醛固定液(pH 7．4) 、0 2％Triton
打孔液、3％的山羊血清100ul 、一抗a-actin (1：300) 、兔抗小鼠的荧光二抗(1：1000) 、 Hoechst 染液、90％甘油。
将平滑肌细胞制作成细胞爬片后，依照免疫荧光法说明书操作：
(1)吸去培养液，用PBS 清洗3次。
(2)4％多聚甲醛室温固定l 5～20min ，PBS 清洗3次，每次3min 。
(3)0 2％Triton 液进行细胞打孔5min ，吸去．PBS 清洗3次。
(4)滴加3％的山羊血清l 50ul于玻片上，湿盒内室温封闭孵爵lh ，啵干。
(5)加入稀释的一抗Ⅱ．actinl 50ul，在室温孵育1.5h 或4℃过夜．PBS 清洗3
次，每次5min 。
(6)加入荧光二抗150ul ，孵育1 5h，PBS 清洗3次，每次5min 。
(7)加A Hoechst液染核，室温孵育10—15min ，PBS 清洗3次，每次5min 。
(8)90％的甘油封片，指甲油固定玻片四角。
(9)在荧光倒置显微镜下．平滑肌胞浆为红色。
2. α-actin 免疫细胞化学法鉴定PASMCs 纯度
（1）将3张盖玻片放入培养皿中，将稀释好的细胞悬液（5×104 cell/ml）滴到盖玻片上。
（2）培养24小时，将盖玻片取出，吸去培养液。4%预冷多聚甲醛固定20分钟，PBS 洗3遍，每次5
分钟。
（3）0.2%tritonX-100通透10分钟，PBS 洗3遍，每次5分钟。
（4）5%羊血清封闭45~60分钟，加入稀释好的α-actin 单克隆抗体，4℃过夜。
（5）PBS 洗3遍，每次5分钟。加入稀释好的相应荧光二抗（1:600）及DAPI （1:500），室温孵育
60分钟。
（6）PBS 洗3遍，每次5分钟。90%甘油封片，指甲油封片子四周。倒置荧光显微镜下观察并拍片。
（7）统计分析。