植物乳杆菌在人体肠道的益生特性
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中国乳品工业
植物乳杆菌在人体肠道的益生特性
靳志强1,2,王延样2
(1.长治学院生化系,长治046011;2.中国农业大学食品科学与营养工程学院功能乳品重点实验室,北京100083)摘
要:植物乳杆菌能够通过胃,并定植于肠道,对人体安全。服用植物乳杆菌后,对健康人群和病患者具有特定的医疗保健作用。同
时,植物乳杆菌分泌生物活性分子,激发免疫反应,可作为活疫苗在医学上广泛应用。另外,随着L.plantarumWCFS1全基因组序列的测出,可用分子手段(如启动子筛选、R-IVET、DNA微矩阵)研究肠道微生态系统的机制和探索植物乳杆菌更深层次的益生特性。关键词:植物乳杆菌;人体肠道;益生特性;活疫苗;分子研究中图分类号:Q935
文献标识码:B
文章编号:1001-2230(2007)09-0030-05
ProbioticpropertiesofLactobacillusplantaruminthehumanintestinaltract
JINZhi-qiang1,2,WANGYan-xiang2
(1.DepartmentofBiochemistry,ChangzhiColllege,Changzhi046011,China;2.KeyLabofFunctionalDairy,CollegeofFoodScienceandNutritionEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083,China)
Abstract:L.plantarumhasaprovenabilitytosurvivegastrictransitandcolonizethegut,withanapparentsafetytotheconsumer.ManystudiesdescribehealthpromotingeffectsofconsumptionofL.plantarumonhealthyvolunteersandpatients.L.plantarumcansecretebioactivemoleculesthatevokeanimmuneresponse,thereforeasalivingvaccineoffersalargerangeoftherapeuticpossibilities.TheavailabilityofthecompletegenomesequenceofL.plantarumWCFS1makesitasuitablemodeltostudywithmolecularapproachessuchaspromoterscreens,R-IVET,andDNAmicro-arrays.Thisisexpectedtocontributetounravelingmoremechanismsbehindthetargetedintestinalmicrobiale-cosystemandpossiblefurtherprobioticpropertiesofL.plantarum.
Keywords:Lactobacillusplantarum;humanintestinaltract;probioticproperty;livingvaccine;molecular
study
0引言
之,这放映了植物乳杆菌在大范围的生境中生存的潜通过DNA微矩阵技术,对植物乳杆菌20个菌株加力[1]。
以比较,结果显示差异主要存在于原噬菌体、IS元件这些可转变区域中,也存在于编码植物乳杆菌素、非核糖体多肽或胞外多糖的区域[2]。
根据世界卫生组织对益生菌的定义,当摄入足够量的活菌,益生菌对宿主具有医疗保健作用。作为益生菌应符合以下几个条件:益生菌必须具有存活能力,并能进行大规模生产;在使用和贮藏期间,应保持存活状态和稳定;在肠内生态系统中必须存活;必须对宿主产生有益作用;应是肠道内正常菌群的正常成员。大量的植物乳杆菌菌株作为益生菌已经得到商业化应用。本文概述了植物乳杆菌在人体肠胃道的安全性、存活性以及对宿主的益生作用,并且阐述了植物乳杆菌在人体肠胃道活动的分子水平的研究。
乳酸菌是一类革兰氏阳性、厌氧生长的细菌,在发酵食品制造中常作为发酵剂以改善食品的风味、质地或者提高食品的保藏期。在食品发酵过程中,乳酸菌将食品原料中的糖转变为乳酸,
同时产生抗菌
肽、胞外多糖和其他代谢产物。植物乳杆菌是一种常见于奶油、肉类及许多蔬菜发酵制品中的乳酸菌,而且在人体胃肠道也常发现植物乳杆菌的存在。最近,
L.plantarumWCFS1的全基因组序列已被鉴定和注解,
证实了植物乳杆菌具有与各种糖类、肽类摄取和利用相关以及与大多数氨基酸形成相关的功能基因。而且,大量编码表面蛋白的基因表明植物乳杆菌能够识别和粘附环境中某些组分,大量编码调节功能蛋白的基因显示了植物乳杆菌对不同环境的适应能力。总
收稿日期:2007-04-25
基金项目:国家863计划目标导向性项目(2006AA10Z343)。作者简介:靳志强(1976-),男,讲师,研究方向为食品生物技术。
1植物乳杆菌的安全性
植物乳杆菌在许多食品如泡菜和橄榄制品中天
然存在和安全使用已有很长的历史。在大量有关安全
302007年第35卷第9期(总第202期)
Monographs专题论述
使用的研究中,植物乳杆菌菌株可能与感染有关鲜有报道。令人关注的是从传染性心内膜炎病灶中分离到了植物乳杆菌。这些菌株体外可通过聚集血小板使血液凝结。由于血液凝结的危险性,所以植物乳杆菌可能具有致病性[3]。然而,植物乳杆菌在体外的凝血性并不能说明它在体内就具有危险性,
因为大量
的乳酸菌都具有该特性。最近的研究表明,人体唾液中分离的L.plantarumNCIMB8826在小鼠体内不会引起组织发炎和穿越肠道屏障的反常易位。相反,患有结肠炎的小鼠喂食L.plantarumNCIMB8826,减少了内源微生物的易位[4]。SD(Sprague-Dawly)大鼠静脉注射L.plantarum299v(109mL-1),96h后这些大鼠死亡,在它们的心脏和血液中不能测到该菌株的存在。所以即使肠道屏障被穿越,也无感染发生。显而易见,该菌株是安全的[5]。而且市场检测报告显示,在菌血病症中没有发现植物乳杆菌的存在。另外,如下所述,多种临床研究显示了植物乳杆菌在人体中的安全使用。
便中的数量极少而不能检测到。三分之二的从口腔和直肠分离到的植物乳杆菌菌株通过表达甘露糖特异性黏附素而与人结肠细胞系HT-29发生粘附,该特性在其他肠道乳杆菌中很少发现。植物乳杆菌和致病菌(包括大肠杆菌)对甘露糖特异性受体的竞争,减少了致病菌对人体细胞的粘附,因而保护宿主免于感染[10]。
3在健康受试者体内的影响
各种植物乳杆菌菌株易于生长,人体来源,研究
者就植物乳杆菌对人体的健康影响做了大量研究。健康受试者每日摄入L.plantarum299,服用3周,发现粪便中羧酸、乙酸、丙酸的含量显著增加,这可能是植物乳杆菌对特异结肠菌作用的结果。因为植物乳杆菌主要产乳酸而不是乙酸,径发生了改变[11]。
健康受试者每日服用含有各种乳杆菌菌株的燕麦粥,发现在其体内肠杆菌数量至少降低100倍,亚硫酸盐还原梭菌数量降低10~100倍,直肠中革兰氏阴性厌氧菌的数量也显著下降。停止服用燕麦粥的第1天和第11天,在空肠和直肠内检测到的乳酸菌主要是L.
并且缺乏编码丙酸合成酶的基
因。加之,大便增多,粪便变软,说明在结肠内发酵途
2在肠道内的存活
植物乳杆菌口头摄入后,遇到一系列人体防御体
系,包括肠黏膜表面高浓度的黏蛋白、胃中可降低pH值的胃酸和胆汁酸盐。L.plantarumWCFS1不能分解利用黏蛋白[1]。另外,发现从肠道内和发酵食品中分离得到的各种植物乳杆菌菌株,对置于盐酸(pH值为2.0)和胆汁酸盐环境中具有高的耐受力。在此逆环境下,植物乳杆菌有0.003%~10%的存活率,副干酪乳杆菌无存活,沙克乳杆菌的存活也非常有限,为0~0.001%[6]。
plantarum299和L.plantarum299v;停止服用的第1天,也
能检测到大量的敏捷乳杆菌,但在第11天,数量则急剧下降;革兰氏阴性厌氧菌在的第11天才有减少,表明经过一段时间乳酸菌菌群建立后,才开始对革兰氏阴性厌氧菌发挥作用[8]。将L.plantarumE98加入到人体肠道微生态模拟系统中,革兰氏阴性厌氧菌数量也有相似的减少[12]。从医学观点来看,革兰氏阴性厌氧菌数量的减少,是有积极意义的,因为经常从肠道手术后的感染部位分离到这些细菌。不到5岁的健康儿童每日摄入一种经L.plantarum299v发酵的称为togwa的米粥,携带的肠致病性细菌减少了6倍之多。在试验的开始阶段,通过直肠抹拭检测到38.9%的儿童携带致病菌,在服用togwa一周后,数量降到6.9%,服用两周后,降到6.1%。作用机理可能是通过合成抑制因子在肠内表现抑制效应,竞争,的运输[13]。
或者是对特异生境和营养物的
或者是摄入无菌的米粥后降低了肠道病原体
L.plantarumNCIMB8826摄入人体内,也显示出高存
活性。健康受试者在服用108活细胞的剂量后,用回肠插管法测定细胞存活率。植物乳杆菌在回肠内的存活率为7%,乳酸乳球菌的存活率为1%,发酵乳杆菌的存活率为0.5%[7]。健康受试者同时摄入不同的乳杆菌菌株,每个菌株每日的摄入量为5×在结束108,服用10d。服用的第11天,发现在85%的健康受试者的空肠和直肠内有L.plantarum299和299v定植,表明植物乳杆菌定植具有人体特异性。在该研究中,植物乳杆菌的定植要远远优于唾液乳杆菌、伊氏乳杆菌、格氏乳杆菌、嗜酸乳杆菌和敏捷乳杆菌,因为用平板计数法分离,用
API-50CH系统和限制分析(restrictionanalysis)鉴定的
菌株,其中三分之二是植物乳杆菌,其余的菌种只能占到三分之一[8]。
植物乳杆菌是肠道内天然存在的一种细菌。从健康者和病患者中取20个结肠和回肠样品,通过平板计数法和表型特征观察仅可从一个样品中分离到植物乳杆菌,然而,从大多数健康者的口腔和直肠能够分离到植物乳杆菌。这表明植物乳杆菌是一种常见的肠道菌,但在在每一个取样位置,是否有植物乳杆菌却存在差异[9]。如果不从外界摄入,植物乳杆菌在粪
LDL-胆固醇和纤维蛋白源水平升高,都可能引
发冠心病。胆固醇适度升高的受试者,摄入L.plantarum
299v后,血液中LDL-胆固醇和纤维蛋白源水平分别
降低了9.6%和13.5%[14]。吸烟过多的抽烟者,摄入2倍剂量的植物乳杆菌,效果更为显著,LDL-胆固醇和纤维蛋白源分别减少了11.7%和21%[15]。作用机理可能是摄入植物乳杆菌后,植物乳杆菌与其他结肠菌作用,引起丙酸生成,丙酸的消炎作用降低了血液中LDL-胆固醇和纤维蛋白源水平[11,14]。
Vol.35,No.92007(total202)
31
专题论述Monographs
4对疾病的影响
植物乳杆菌引起的免疫刺激日益引起研究者的
记。对小鼠灌胃后,在分泌黏液的内腔中可检测到荧光细菌。然而,在小肠的潘氏结(Peyer'spatches)上却没有发现植物乳杆菌细胞的存在,这可能是灌胃的细胞数量较少的缘故。通过鼻腔黏膜给药,植物乳杆菌出现于巨噬细胞中,表明该免疫途径也是适宜的[27]。另有研究,将分泌破伤风毒素片段C抗原的植物乳杆菌用于小鼠的免疫。结果表明,灌胃和鼻腔黏膜给药途径都是适宜的。植物乳杆菌分泌抗原并传送到细胞表面,引起免疫应答。该免疫应答比细胞质中的抗原引起的免疫应答更为有效[28]。与乳酸乳球菌相比,植物乳杆菌可提供更高的免疫力,可能是该菌株具有良好的植物乳杆菌细胞壁缺陷突变株,免疫持久性的原因[26]。
缺乏丙氨酸消旋酶基因,在鼠科动物的肠道中与野生型菌株具有同样的免疫持久性。然而,突变株产生的免疫性要远远高于野生型菌株[29]。植物乳杆菌在小鼠试验中可抑制屋尘螨(housedustmite)特异性的T细胞反应,从而有可能利用植物乳杆菌治疗过敏症[30]。总之,许多研究表明了植物乳杆菌可分泌生物活性分子,激发免疫反应。一般来讲,由于植物乳杆菌制备便利,易于基因改造,并且在胃肠道具有良好的益生特性,因此比其他食品级乳酸菌更为研究者所青睐。
关注。许多临床试验证实了摄入植物乳杆菌对不同疾病的影响。有研究表明,L.plantarum299v能够在先天患有艾滋病的儿童体内定植,使这些儿童的体重和特异性免疫应答增加[16]。另有报道称致炎细胞因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可使上皮细胞HT-29对L.plan-的存在导致了白介tarum299v变得敏感。虽然TNF-α
素-8(IL-8)mRNA的增加,但添加植物乳杆菌降低了上皮细胞中IL-8的分泌,从而起到了免疫保护效果[17]。植物乳杆菌引起免疫刺激的机理在动物试验中得到证实。小鼠口服L.plantarumCRL936后,刺激派氏集合淋巴结(Peyerspatches)中的微褶细胞(M-Cell),这不仅增强了肠道和支气管中IgA+细胞的特异性免疫,而且增强了CD4+T细胞的非特异性免疫[18]。
许多研究表明,植物乳杆菌可抑制肠道感染,起到保护作用。在一个双盲、安慰剂对照试验中,患者将抗生素和L.plantarum299v配合服用,难辨梭菌相关性腹泻的复发率降低[19]。应用尤斯室(Ussingchamber)技术,将L.plantarum299v(109mL-1)混入小鼠的饮用水中,发现植物乳杆菌可以抑制大肠杆菌引起的肠道通透性增加[20]。研究者将肠上皮T-84单层细胞与植物乳杆菌预培养,降低了致病性大肠杆菌对上皮细胞的黏附,减少了中性粒细胞迁移等炎性因子[21]。这可能是由于植物乳杆菌和大肠杆菌竞争甘露糖特异结合位点,从而达到竞争排斥的效果;也可能是诱导HT-29细胞中MUC2和MUC3基因表达,随后刺激粘蛋白生成,阻止了大肠杆菌的黏附[22]。
肠易激综合征(IBS)的致病机理尚不清楚,但肠道菌群失调是一个重要因素。众所周知,摄入植物乳杆菌,可以影响肠道菌群平衡。研究表明,每日摄入
6模拟肠道环境对植物乳杆菌的影响
尽管研究者就植物乳杆菌对宿主的生理影响做
了大量研究,但对植物乳杆菌摄入后在肠道环境中的基因表达与功能特性的关系,研究还很肤浅。全基因组序列的测定与植物乳杆菌在肠道内的活动结合起来,将使人们对植物乳杆菌深层的潜在的益生特性有更广阔的了解。
研究者通过体外试验,对模拟肠道环境中的开关基因进行测定。用低拷贝数的质粒载体把L.plantarum
tis缺少启动WCFS1基因组的随机片段克隆到L.lac
子的丙氨酸消旋酶(alr)基因的上游序列中,可得到对基因组98%覆盖率的质粒文库。该质粒文库引入
400mL含L.plantarum299v的玫瑰茄饮料,服用4周后,
发现肠易激综合征患者的腹涨和腹痛减弱[23]。
结肠癌主要是通过手术切除治疗,有时在手术后采用外放射治疗以避免复发。为了减少腹泻、黏膜萎缩等手术后并发症,对小鼠肠道喂养L.plantarum299v,发现可以减少炎症,加快伤口愈合[24]。然而,用植物乳杆菌对患者辅助治疗,效果并不理想。患者在手术前服用植物乳杆菌1周,却没有发现可抑制手术后伤口感染[25]。
L.plantarum△alr菌株中,筛选D-丙氨酸营养缺陷型克
隆菌株。有8个克隆菌株可高效表达丙氨酸消旋酶,并且含有植物乳杆菌启动子,可编码细胞膜整合蛋白、甘油酸盐激酶、透性酶、短链脱氢酶和多种功能未知的蛋白[31]。利用相同的丙氨酸消旋酶互补法在0.1%的猪胆汁中设计一个更加精细的筛选,
诱导31个基因
表达。其中,11个功能基因与细胞壁和细胞膜相关,5个功能基因与氧化还原反应相关,还有5个功能基因与调控因子相关[31]。另有研究通过体外试验利用
5作为活疫苗的应用
植物乳杆菌作为一种活疫苗,为黏膜免疫系统提
DNA微矩阵对含0.1%的猪胆汁的MRS培养基中生
长的L.plantarumWCFS1和标准MRS培养基中生长的L.plantarumWCFS1加以比较。这种全面筛选方法揭示了胆汁胁迫蛋白、细胞膜定位蛋白以及氧化还原反应相关蛋白对基因表达的调控[32]。在这些研究中,植
供异性抗原,与传统的接种免疫相比,具有许多优点,例如非侵入性、激发全身免疫应答和黏膜免疫应答等[26]。为了确定植物乳杆菌对宿主最适宜的免疫方式,用绿色荧光蛋白(GFP)对L.plantarumNCIMB8826标
322007年第35卷第9期(总第202期)
Monographs专题论述
物乳杆菌细胞壁发生变化,大概是细胞在不利环境下的一种保护机制。由于一些调控基因受体外试验的影响,特异性调控环路在肠道条件下是否进行还有待于研究。并且,很难从体外条件下得到的数据来推断它们在肠道条件下的数据。因此,植物乳杆菌在肠道内的基因表达方式值得探讨。
降低病原性等,是近年来较新的研究领域。随着研究手段的不断更新和研究层次的不断深入,新一代益生菌的出现将不再遥远。
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7肠道对植物乳杆菌的影响
在小鼠肠内植物乳杆菌特异性的开关基因已用
R-IVET技术检测出来。这些开关基因对应的功能很
广,包括氨基酸、核酸和维生素的摄取与合成,以及与糖相关的功能。另外,发现与胁迫相关的功能基因也被特异性表达,反映了肠道对细菌是一种逆环境。有趣的是,发现在肠道内植物乳杆菌的诱导基因与相同条件下病原体的诱导基因有很大的重叠[33]。为了验证
R-IVET方法的有效性,用定量RT-PCR检测基因在
肠道内的表达,表达的基因有编码细胞表面蛋白、运输体、铜转运ATP酶、乙醇脱氢酶、纤维二糖磷酸转移酶系统(cellobiosePTS)的基因以及与糖代谢相关的基因[34]。
尽管小鼠模型是研究微生物活动的理想体系,但准确的结果还是来自于人体系统内的试验。研究者利用DNA微矩阵检测植物乳杆菌在结肠癌患者需手术切除的肠道片段中的基因表达。结肠癌患者要求在手术前服用含L.plantarum299v的发酵燕麦粥(每天服用氨基酸生1011活细胞)1周,可以观察到与糖吸收代谢、
物合成、细胞分裂、应激蛋白有关的基因的特异性表达,表明了植物乳杆菌细胞存活、代谢活动和生长都或多或少与人体肠壁有关。与临床研究相结合,DNA微矩阵技术将是研究宿主体内微生物间相互作用的强大的高通量的工具。尽管研究肠道内基因表达的手段不同,宿主不同,小鼠肠内用R-IVET检测出的46%的基因通过DNA微矩阵试验在人体内得到表达。这表明小鼠和人体的肠胃道环境对植物乳杆基因的总体表达有相似的影响[35]。
8结论
植物乳杆菌能够在肠胃道存活并定植于肠道,对人体安全。许多研究描述了服用植物乳杆菌对人体的生理影响。摄入植物乳杆菌后,粪便中携带的肠细菌数量减少,冠心病的致病因子的水平降低,IBS的症状减轻。同时,植物乳杆菌分泌生物活性分子,激发免疫反应,可作为活疫苗在医学上提供更广泛的治疗。另外,L.plantarumWCFS1全基因组序列的测出,有助于用分子手段(如启动子筛选、R-IVET和DNA微矩阵)研究有关胃肠道微生态系统的机制和探索植物乳杆菌更深层次的功能特性。如,植物乳杆菌对甘露糖特异性受体的竞争性粘附、诱导人体黏液素基因表达以
Vol.35,No.92007(total202)
33
专题论述Monographs
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